УДК 636.2:619:579.881.31:577.21:579.083.1
doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.825rus
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ Anaplasma marginale
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
С.Н. КОВАЛЬЧУК1, Г.Ю. КОСОВСКИЙ1, А.В. АРХИПОВ1, Т.Т. ГЛАЗКО1,2, В.И. ГЛАЗКО1,2
Риккетсия Anaplasma marginale — возбудитель анаплазмоза крупного рогатого скота. Заболевание протекает с признаками анемии, лихорадки и потерей веса, вызывает аборты и снижение удойности у коров и во многих случаях приводит к гибели зараженных животных. A.marginale переносится клещами и кровососущими насекомыми. Анаплазмоз обычно диагностируется при микроскопическом исследовании мазков крови, окрашенных по Романовскому красителем Гимза, но этот метод ненадежен, если животное находится на ранних стадиях инфицирования. Широко используются серологические методы диагностики, однако они не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм. Подход, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, сочетает высокую специфичность анализа и возможность количественной оценки числа копий ДНК патогена в образце. Цель выполненного нами исследования — разработать метод дифференцированного выявления A. marginale в крови крупного рогатого скота с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве мишени для амплификации был выбран однокопийный ген msp4. Msp4 — иммунодоминантный белок наружной мембраны всех известных на сегодняшний день риккетсий рода Anaplasma. Праймеры на основе гена msp4 для филогенетического анализа А. marginale ранеебыли предложены J. de la Fuente с соавт. (2001), однако они не видоспецифичны. В результате анализа нуклеотидных последовательностей гена msp4 разных изолятов A. marginale и близкородственных видов анаплазм, включая A. ovis, выявили характерные для A. marginale участки, на основе которых были разработаны видоспецифичные праймеры и флуоресцентно меченный зонд (MSP4-F 5′-CA-TGAGTCACGAAGTGGCT-3′ и MSP4-R 5′-GGCACACT-CACATCAATC-3′, MSP4-probe 5′-(Cy5)-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-3′) для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A.marginale длиной 177 п.н. методом ПЦР в реальном времени. Анализ амплифицированных нуклеотидных последовательностей показал, что они имеют 99-100 % идентичности с фрагментом гена msp4 у разных изолятов A. marginale. При определении аналитической чувствительности ПЦР была сконструирована плазмида pGEM-msp4 с фрагментомгенаmsp4 длиной 177 п.н.и получены образцы, содержащие 100-107 копий msp4. Показано, что чувствительность метода позволяет выявлять от 102 копий гена msp4 А.marginaleв анализируемом объеме образца ДНК.Для испытания аналитической специфичности праймеров и зонда использовались образцы ДНК овец, зараженных риккетсиями A. ovis,а также ДНК коров, которые по результатам секвенирования содержали ДНК бактерий Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnesи Pseudomonas aeruginosa. При этом роста флуоресценции, характерного для материала от зараженных A. marginaleживотных,и каких-либо продуктов ПЦР при электрофоретическом разделении не наблюдали. Таким образом, специфичность метода позволяет надежно дифференцировать A. marginale и A. ovis. Разработанный способ выявления A. marginale на основе амплификации и детекции фрагмента гена msp4 с помощьюПЦР в реальном времениотличается от существующих аналогов высокой специфичностью, быстротой, а также возможностью количественной оценки бактериальной нагрузки. Метод может быть использован для оперативного дифференциального обнаружения и количественного определения А. marginale в образцах крови инфицированного крупного рогатого скота с целью подтверждения диагноза и при проведении эпидемиологического мониторинга анаплазмоза.
Ключевые слова: Anaplasma marginale, ген msp4, крупный рогатый скот, диагностика, ПЦР в реальном времени.
DEVELOPMENT OF REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION OF
Anaplasma marginale
S.N. Koval’chuk1, G.Yu. Kosovskii1, A.V. Arkhipov1, T.T. Glazko1,2, V.I. Glazko1,2
Anaplasma marginale is a rickettsial pathogen responsible for bovine anaplosmosis, the acute disease in cattle herds which is associated with anemia, fever, rapid loss of milk production and weight, abortion, and, in some cases, death of the infected cattle. Anaplasma marginale is transmitted by ticks and biting insects. Diagnosis of bovine anaplasmosis is made by microscopic examination of blood smears stained with Giemsa stain, but this method is not useful to detect presymptomatic animals. Several serological tests have used extensively for epidemiological studies, but they do not discriminate between different Anaplasma species. A real-time polymerase chain reaction (PCR) combines high specificity with accurate measurement of DNA copy number and allows quantification of the targeted pathogen DNA. The goal of this study was to develop a real-time PCR assay for differential detection of A. marginale in the blood of cattle. The single-copy gene msp4 was chosen as a target DNA for PCR. Msp4 is a dominant immune protein of outer membrane of all Anaplasma knowen to date. The primers for phylogenetic analysis in А. marginale based on msp4 were reported earlier by J. de la Fuente et al. (2001), but they were not species-specific. The analysis of msp4 gene sequence of different A. marginale isolates and closely related species, including A. ovis, revealed species-specific areas, which were used for design of primers and TaqMan probe (MSP4-F 5′-CA-TGAGTCACGAAGTGGCT-3′ and MSP4-R 5′-GGCACACT-CACATCAATC-3′, MSP4-probe 5′-(Cy5)-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-3′) for amplification and detection of 177 bp fragment of msp4 gene by a real time PCR. In the amplified nucleotide sequences a 99 to 100 % homology to msp4 fragments was found in different isolates of A. marginale. To assess analytical sensitivity of our PCR test, we used pGEM-msp4, a constructed recombinant plasmid with 177 bp fragment of msp4 gene, diluted to obtain samples with 100-107 msp4 copies. It was shown that the assay was able to detect as few as 102 of A. marginale msp4 gene in the analyzed DNA sample. Analytical specificity of the developed primers and the MSP4-probe was proved in tests with DNA of sheep naturally infected by A. ovis,and also DNA isolated from cows with Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes and Pseudomonas aeruginosa infection pre-detected by sequencing. In these samples no increased fluorescence characteristic of probes from animals infected by A. marginale was observed with no PCR products identified. Thus, the method specificity allowed to differ A. marginale and A. ovis. The developed method of A. marginale identification on the basis on amplification and detection of the msp4 gene fragment using a real time PCR differed from known analogues with high sensitivity, rapidity and opportunity of quantitative evaluation of the bacterial load. The developed method could be used for rapid differential detection and quantification of А. marginale in blood samples from infected cattle for confirmation of anaplasmosis and epidemiological studies.
Keywords: Anaplasma marginale, msp4 gene, cattle, diagnostics, a real-time PCR.
1ФГБНУ Центр экспериментальной эмбриологии |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
