УДК 636.294:575.174:575.113:577.2.08:51-76
doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.756rus
Исследования выполнены при поддержке Российского научного фонда, проект № 14-36-00039. При проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.
РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПАНЕЛИ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ
ДЛЯ ОЦЕНКИ ДОСТОВЕРНОСТИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ И СТЕПЕНИ
ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ
СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ Rangifer tarandus
В.Р. ХАРЗИНОВА1, Е.А. ГЛАДЫРЬ1, В.И. ФЕДОРОВ1, 2, Т.М. РОМАНЕНКО3, Л.Д. ШИМИТ4, К.А. ЛАЙШЕВ5, Л.А. КАЛАШНИКОВА6, Н.А. ЗИНОВЬЕВА1
Северный олень (Rangifer tarandus), единственный представитель рода Rangifer, принадлежит к числу наиболее интересных объектов исследования генетического разнообразия. Создание панелей STR (short tandem repeats) маркеров — один из приемов изучения генетической структуры популяций и оценки достоверности происхождения животных. Целью настоящей работы стала разработка мультилокусной панели анализа STR маркеров и оценка ее информативности для контроля достоверности происхождения и изучения биоразнообразия российских популяций северного оленя. В качестве биологического материала для исследований использовали образцы тканей (пробы уха) северного оленя эвенской (EVN, n = 44), эвенкийской (EVK, n = 44), ненецкой пород (n = 45) и оленей тувинской популяции (TUV, n= 35). ДНК выделяли с использованием колонок фирмы «Nexttec» (Германия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Полиморфизм девяти STR (NVHRT76, RT9, NVHRT24, RT30, RT1, RT6, RT27, NVHRT21, RT7) определяли по собственным методикам с использованием ДНК-анализатора ABI3130xl («Applied Biosystems», США). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета MS Excel 2007 с плагином GenAIEx v. 6.5, программного обеспечения MSA 4.05, Phylip, v. 3.5c, Treev32 и Structure, v. 2.3.4. Исследуемые популяции северного оленя характеризовались относительно высокой степенью генетического разнообразия. Среднее число аллелей на локус составило 6,11±0,56 у TUV; 6,67±0,50 — у NEN; 8,00±0,76 — у EVN и 8,89±0,65 — у EVK. Наименьшим числом эффективных аллелей на локус характеризовалась популяция TUV (3,37±0,47), максимальным — EVK (4,89±0,46), популяции EVN и NEN занимали промежуточное положение (соответственно 4,42±0,53 и 3,90±0,38). Число аллелей в отдельных локусах варьировало от 4 (в локусах NVHRT21 и NVHRT24 у TUV) до 12 (в локусе RT7 у EVK и в локусе RT1 у EVN). Вероятность совпадения генотипов (PI) по девяти локусам составила от 1,8×10-9 у NEN до 5,9×10-11 у EVK, что подтвердило высокую информативность предложенной панели в контроле достоверности происхождения. Расчет среднего значения коэффициента членства Q в i-м кластере для наиболее вероятного числа кластеров k = 3 и k = 4 (Qi/k) показал неоднородность генетической структуры всех исследованных популяций. Наибольшей генетической обособленностью характеризовались популяции TUV (Q2/3 = 0,899±0,034, Q3/4 = 0,883±0,035) и NEN (Q3/3 = 0,885±0,031, Q4/4 = 0,813±0,038). Изучаемые популяции пород EVN и EVK были дифференцированы в меньшей степени, и четкой кластеризации между ними не обнаружили. Расчет значения Rst (AMOVA) показал, что общая молекулярная изменчивость была на 11,4 % обусловлена различиями между популяциями и на 88,6 % — индивидуальными различиями между животными (p < 0,01). При оценке степени генетической дифференциации изучаемых популяций с использованием в качестве критериев значений генетических дистанций по M. Nei и индекса Fst при парном сравнении были выявлены сходные тенденции. Популяция TUV характеризовалась наибольшей удаленностью от остальных (DNei = 0,283-0,502, Fst = 0,299-0,452), при этом она оказалась наиболее дифференцирована от NEN и более близка к EVN. Минимальные генетические различия отмечались между EVN и EVK (DNei = 0,068, Fst = 0,032). Полученные результаты подтвердили высокую функциональную емкость разработанной STR панели как для анализа достоверности происхождения, так и для изучения биоразнообразия российских популяций северного оленя.
Ключевые слова: породы северного оленя, Rangifer tarandus, микросателлиты, биоразнообразие.
V.R. Kharzinova1, E.A. Gladyr’1, V.I. Fedorov1, 2, T.M. Romanenko3, L.D. Shimit4, K.A. Layshev5, L.A. Kalashnikova6, N.A. Zinovieva1
Reindeer (Rangifer tarandus), the only member of the genus Rangifer, is one of the most interesting object to investigate genetic diversity. One of the technique of studying the genetic structure of populations and parentage identification is to create panels of STR (short tandem repeats) markers. The aim of the current study was the development of multiplex panel of STR markers and assessment of its application to assign the parents and to study biodiversity of Russian reindeer populations. As a biological material for research we used tissue samples (part of ear’s lobes) of reindeer of Even (EVN, n = 44), Evenk (EVK, n = 44), Nenets (n = 45) breeds and Tyva population (TUV, n = 35). DNA extraction was performed using Nexttec columns (Germany) according to the manufacturer’s instructions. Polymorphism of nine STR markers (NVHRT76, RT9, NVHRT24, RT30, RT1, RT6, RT27, NVHRT21 and RT7) was determined by own procedures using ABI 3130xl DNA analyzer («Applied Biosystems», USA). Statistical analysis was performed in MS Excel 2007 with the plugin GenAIEx v. 6.5, software MSA 4.05, Phylip, v. 3.5c, Treev32 and Structure, v. 2.3.4. The studied populations of reindeer were characterized by relatively high levels of genetic diversity. The average number of alleles per locus was 6.11±0.56 in TUV, 6.67±0.50 in NEN, 8.00±0.76 in EVN and 8.89±0.65 in EVK. The smallest effective number of alleles per locus was detected in TUV (3.37±0.47), the maximal value was in EVK (4.89±0.46 alleles per locus), and EVN and NEN occupied an intermediate position (4.42±0.53 and 3.90±0.38, respectively). The number of alleles in single loci ranged from four in NVHRT21 and NVHRT24 for TUV to twelve in RT7 for EVK and RT1 for EVN. The probability of matching genotypes (PI) for the nine loci ranged from 1.84×10-9 in NEN to 5.9×10-11 in EVK, showing the high power of the proposed marker panel for parentage identification. The calculation of the mean values of similarity coefficient Q in the ith cluster with the most probable number of clusters such as k = 3 and k = 4 (Qi/k) revealed high heterogeneity of genetic structure of studied populations. The highest degree of genetic differentiation was shown for TUV (Q2/3 = 0.899±0.034, Q3/4 = 0.883±0.035) and for NEN (Q3/3 = 0.885±0.031, Q4/4 = 0.813±0.038). The EVN and EVK population were close to each other, and a clear clustering between them was not observed. An estimation of Rst (AMOVA) showed that 11.4 % of the total molecular variability was caused by differences between populations, and 88.6 % was due to individual differences between animals (p < 0.01). Evaluation of degree of genetic differentiation of studied populations, using as criteria the values of Nei’ genetic distances and pairwise comparisons of Fst showed similar trends. TUV population was the most distinct comparing to other populations (DNei = 0,283-0,502, Fst = 0,299-0,452), while it was the most differ from NEN and the closest to EVN. The minimal genetic differences were observed between EVN and EVK (DNei = 0,068, Fst = 0,032). The results show high functional power of the developed STR panel to identify the parentage and to study biodiversity in Russian reindeer populations.
Keywords: reindeer breeds, microsatellites, biodiversity, Rangifer tarandus.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ животноводства
|
Потупила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
