УДК 619:616.98:578:577.2.08:57.083.224
doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.794rus
ОПТИМИЗАЦИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АТТЕНУИРОВАННОГО
ШТАММА 1974-ВНИИВВиМ ВИРУСА ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ
И.Р. ИМАТДИНОВ, В.И. БАЛЫШЕВА, В.Н. ПОНОМАРЕВ, О.В. КАПУСТИНА
Возможность распространения лихорадки долины Рифт (ЛДР) в Азию и Европу в последние десятилетия вызывает серьезные опасения. На протяжении многих лет ведутся разработки вакцин против ЛДР в нескольких направлениях, включая получение аттенуированных вакцинных вариантов вируса, инактивированных и генно-инженерных вакцин. Высокая вредоносность возбудителя ЛДР поставила перед нами задачу создания достаточно иммуногенного средства специфической профилактики ЛДР и обеспечения безопасности его производства. Поэтому целью представляемой работы стало изучение молекулярно-биоло-гических свойств аттенуированного вируса ЛДР штамм 1974-ВНИИВВиМ, в том числе поиск высокотехнологичных культуральных клеточных систем для культивирования вируса и определения его антигенного и иммуногенного родства с вирулентным штаммом Entebbe. Результаты исследований показали, что в перевиваемых культурах клеток почки сайги (ПС), почки зеленой мартышки (CV-1) и почки сирийского хомячка (ВНК-21/13) вирус накапливается в высоких титрах при инфекционной активности 8,23±0,21 lg MLD50/см3 и антигенной активности в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в разведениях 1:64-1:128. Нами отработаны параметры культивирования вируса роллерным методом в культуре клеток ПС: скорость вращения культуральных бутылей — 12-15 об/ч; доза заражения — 0,01-0,001 MLD50/кл; рН 6,4-6,8 в первые 12 ч культивирования. Последующее поддержание рН в пределах 7,2-7,6 в течение 48-72 ч культивирования при 37 °С обеспечивает получение вирусного сырья с высокой инфекционной (8,5±0,2 lg MLD50/см3) и антигенной активностью: титр в РПГА — 1:128-1:256, при твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ-ИФА) — 1:625-1:3125. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей трех участков S- и M-сег-ментов вирусного генома, выполненный по методу максимального правдоподобия на основе модели K. Tamura и M. Nei (1993), позволил установить высокую степень родства штамма 1974-ВНИИВВиМ с известными штаммами Smithburn (аттенуированный) и Entebbe (вирулентный), что дает основание выделить их в отдельный кластер. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N, показал, что большая часть замен в последовательностях указанных генов у штамма 1974-ВНИИВВиМ вируса ЛДР синонимичны и не приводят к изменению первичных аминокислотных последовательностей, вставки и делеции отсутствуют. В нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин Gn штамма 1974-ВНИИВВиМ, нами выявлены восемь замен относительно аналогичной последовательности М-сегмента генома у вирулентного штамма Entebbe и 14 замен при сравнении с М-сегментом у штамма Smithburn. У штамма 1974-ВНИИВВиМ по сравнению с другими аттенуированными штаммами установлено низкое число значимых аминокислотных замен в антигенных компонентах вируса ЛДР, что подтверждает обоснованность выбора штамма 1974-ВНИИВВиМ в качестве источника генов иммунодоминантных белков и сырья для производства вакцин.
Ключевые слова: лихорадка долины Рифт, культивирование вируса, антигенность, иммуногенность, электронная микроскопия, филогенетический анализ.
I.R. Imatdinov, V.I. Balysheva, V.N. Ponomarev, O.V. Kapustina
In recent decades, a threat of spreading Rift Valley fever (RVF) to Asia and Europe raises serious concerns. Within many years, vaccines against RVF were developed in several ways including designing attenuated vaccine versions, inactivated or genetically engineered vaccines. A serious hazard of the RVF agent requires developing sufficiently immunogenic preparations providing both RVF specific prevention and safety precautions in production procedures. Therefore, this work was aimed at molecular and biological characterization of an attenuated RVF virus (RVFV) strain 1974-VNIIVViM including search for high-tech cell culture systems for the virus growth and determination of its antigenic and/or immunogenic relationship with a virulent strain Entebbe. The results of the investigations showed that the virus accumulated in continuous cell cultures like saiga kidney (SK), Siberian mountain goat kidney (PSGK-60) and MDVK (calve kidney cell culture) at high titers with infectious (8.53±0.21 lg MICLD50/cm3) and antigenic (1:64 to 1:128 in the passive hemagglutination test, PHT) activity levels. We determined optimal regime of the virus growth in BHK-21/13 (Syrian hamster kidney cell culture) using a roller culture method: the culture bottle rotation speed of 12 to 15 r.p.h.; the infection dosage of 0.01 to 0.001 MLD50/cell; the first 12 hours of the culture at pH = 6.4 to 6.8. Further, pH is maintained at 7.2 to 7.6 for 48 to 72 hours of culture at 37 °С, which provides the raw virus production at high infectivity (8.5 to 8.9±0.2 lg MICLD50/cm3) and antigenicity (1:128 to 1:256 in PHT and 1:625 to 1:3125 in solid phase ELISA) levels. Phylogenetic analysis of the nucleotide sequences of 3 sites in S and/or M segments showed that it was closely related to strains Smithburn and Entebbe allowing their grouping into a separate cluster. Comparative analysis of nucleotide sequences of genes encoding glycoproteins Gn and Gc, and the nucleoprotein N, shows that most of the substitutions in the sequences of the genes of the RVFV strain 1974-VNIIVViM are synonymous and do not alter the primary amino acid sequence, with insertion and deletion missing. In the nucleotide sequence encoding glycoprotein Gn of strain 1974-VNIIVViM we found 8 substitutions relative to a similar sequence of M segment of a virulent strain Entebbe, and 14 substitutions when compared with M segment of strain Smithburn. A lower (as compared with other attenuated strains) amount of significant amino acid substitutions in RVFV antigenic components was revealed; thus, strain 1974-VNIIVViM selection as a source of immunodominant proteins and/or raw virus for vaccine production seems to be well-grounded.
Keywords: Rift Valley fever, viral culture, antigenicity, immunogenicity, electron microscopy, phylogenetic analysis.
ФГБНУ Всероссийский НИИ ветеринарной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
