УДК 636.1:619:616.155.194:578:577.2.08
doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.803rus
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РОССИЙСКИХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ОПТИМИЗИРОВАННОЙ ДВУХРАУНДОВОЙ ПЦР
Н.Н. ГЕРАСИМОВА, О.Л. КОЛБАСОВА, С.Ж. ЦЫБАНОВ, Д.В. КОЛБАСОВ
Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) — болезнь однокопытных, вызываемая вирусом рода Lentivirus семейства Retroviridae. Заболевание широко распространено, и его эпизоотии зарегистрированы практически на всех континентах земного шара. В Российской Федерации из года в год при плановых исследованиях на присутствие антител к вирусу ИНАН выявляются животные, серопозитивные в реакции диффузионной преципитации (РДП). В настоящее время опасность распространения вируса ИНАН признается во всем мире, а его контролю уделяется большое внимание, в связи с чем проводятся многочисленные исследования по выявлению вируса, определению его молекулярно-генетических характеристик и происхождения. В настоящей работе представлены данные по разработке тест-системы на основе ПЦР, позволяющей не только выявлять геном вируса ИНАН в различных образцах биологического материала, но и проводить дальнейшее секвенирование фрагментов генома этого инфекционного агента. Геном вируса ИНАН состоит из трех основных генов — gag, pol, env (распложены в направлении 5’→3’), из которых наиболее полезным маркером для изучения генетического разнообразия и филогенетических взаимоотношений между различными штаммами вируса ИНАН считается gag-ген, необходимый для внутриклеточной сборки и выхода вируса из клетки. С целью проведения молекулярно-генетических исследований нами была оптимизирована двухраундовая ПЦР без этапа обратной транскрипции и рассчитаны специфические олигонуклеотидные праймеры для второго раунда реакции, фланкирующие участок gag-гена провирусной ДНК вируса ИНАН размером 1018 п.н. В результате проведенных изысканий также были определены нуклеотидные последовательности и филогенетические отношения ранее выделенного отечественного штамма вируса ИНАН и двух современных изолятов, выявленных на территории нашей страны. Полученные данные позволили отнести штамм 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ к группе североамериканского происхождения (гомология 98 %), а изоляты Нижний Новгород-2011 и Омск-2012 — к группе европейских (гомология 82-83 %). Таким образом, разработанная нами система идентификации вируса ИНАН с помощью ПЦР и филогенетического анализа позволяет устанавливать принадлежность выделяемых изолятов к определенной геногруппе и, следовательно, предположить их географическое происхождение. Эта информация необходима для определения источника и путей распространения возбудителя с целью прогнозирования эпизоотической ситуации и планирования мер борьбы с болезнью.
Ключевые слова: ИНАН, ПЦР, филогенетический анализ.
PHYLOGENETIC ANALYSIS OF RUSSIAN EIAV ISOLATES USING
AN OPTIMIZED NESTED PCR
N.N. Gerasimova, O.L. Kolbasova, S.Zh. Tsybanov, D.V. Kolbasov
Equine infectious anemia (EIA) is a viral disease wich affects all members of Equine species and is caused by а virus belonging to the genus Lentivirus in the family Retroviridae. This disease has a worldwide distribution, and its epizooty is registered in all continents. AGID positively reacting animals are revealed at planned serological studies in the Russian Federation from year to year. At the moment, a lot of attention is paid to control of the EIA virus prevalence, therefore, all over the world there are numerous studies to identify the virus and determine its molecular and genetic characteristics and origin. This paper presents data on the development of test systems based on PCR, which allows not only to identify the EIA viral genome in various samples of biological material, but also to carry out further sequencing the genome fragments of different EIA strains and isolates. EIA virus genome consists of three major genes, gag, pol, env (5’→3’). Аnd the most useful marker for studying genetic diversity between different EIAV strains is a gag-gene necessary for intracellular virus assembly and release from cells. For carrying out the molecular genetic studies, we optimized nested PCR without reverse transcription and designed specific oligonucleotide primers for the second round of the reaction which flanking 1018 bp of proviral DNA of gag-gene. In the research we also determined the nucleotide sequence and phylogenetic relationships between previously isolated Russian EIAV strain and two modern isolates revealed in Russia. The findings allowed assigning 3-K-VNIITIBP-VIEV EIAV strain to group of North American origin with homology of 98 %. Isolates Nizhniy Novgorod-2011 and Omsk-2012 were classified as isolates of European origin with 82-83 % homology. Thus, application of PCR and a phylogenetic analysis allows to establish the belonging of new virus isolates to a certain genogroups and to assume their geographical origin. This information is necessary to determine the source and ways of distribution of the pathogen for the purpose to predict future epidemic situation and planning measures against the disease.
Keywords: EIAV, PCR, phylogenetic analysis.
ФГБНУ Всероссийский НИИ ветеринарной |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
