Сельскохозяйственная биология, 2014, № 6, с. 81-85.

УДК 636.1:619:616.155.194:577.2:57.083

doi: 10.15389/agrobiology.2014.6.81rus

ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ

Н.Н. ГЕРАСИМОВА, O.Л. КОЛБАСОВА, С.Ж. ЦЫБАНОВ, А.В. ЛУНИЦИН, Д.В. КОЛБАСОВ

Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) — вирусная болезнь однокопытных, вызываемая РНК-содержащим вирусом из рода Lentivirus семейства Retroviridae. Она сопровождается поражением органов кроветворения и проявляется рецидивирующей или постоянной лихорадкой, анемией и нарушением функций сердечно-сосудистой системы. Своевременная диагностика ИНАН — единственный надежный способ контроля заболевания. Для этой цели предложены различные серологические и молекулярно-генетические методы. Серологические методы исследования при ИНАН имеют определенные недостатки. С их помощью невозможно выявить больных животных до начала сероконверсии, кроме того, зарегистрированы случаи иммунодефицитного состояния лошадей, при котором вирусспецифические антитела образуются в количестве, недостаточном для их обнаружения. В настоящей работе представлены данные по сравнительной оценке различных серологических и молекулярно-генетических методов диагностики инфекционной анемии лошадей при экспериментальном воспроизведении инфекции у восприимчивого животного. Использовали соответственно реакцию диффузионной преципитации (РДП), иммуноферментный анализ (ИФА) и способы обнаружения фрагментов генома вируса ИНАН с помощью гнездовой ПЦР с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и электрофоретической детекцией, а также ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Разработанные тест-системы для ПЦР-диагностики основаны на амплификации фрагментов gag-гена вируса ИНАН с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. При исследовании проб крови, взятой на 2-е сут после экспериментального заражения, получен положительный ответ в гнездовой ОТ-ПЦР с электорофоретической детекцией и в ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Далее геном вируса ИНАН выявлялся методом ОТ-ПЦР до конца срока наблюдения, составлявшего 35 сут. Специфические антитела в сыворотке крови обнаруживали методом РДП, начиная с 30-х, ИФА — с 21-х сут после инфицирования. Таким образом, ПЦР можно эффективно применять в качестве специфичного экспресс-метода для выявления генома вируса ИНАН в период до начала сероконверсии с последующей верификацией другими лабораторно-диагностическими методами. Для предлагаемых отечественных тест-систем и рекомендованных методик исследования подтверждены преимущества использования ПЦР-диагностики на ранних сроках заболевания ИНАН.

Ключевые слова: инфекционная анемия лошадей, экспериментальное воспроизведение инфекции, ОТ-ПЦР, серодиагностика.

Полный текст

EXPERIENCE OF USING SEROLOGICAL AND MOLECULAR TESTS TO DETECT EQUINE INFECTIOUS ANEMIA VIRUS IN HORSE

Equine infectious anemia in horses is caused by equine infectious anemia virus (EIAV, Lentivirus, Retroviridae), affecting hematopoietic organs. The symptoms of the disease are relapsing or continued fever, anemia and a disturbance of cardiovascular functions. Duly virus detection is the only effective way to control infection. Serological methods used to indicate EIAV have some limitations. For instance, they did not allow identifying infected animals prior to seroconversion. Also an immunodeficiency can really occur when the content of virus specific antibodies is too low to be indicated. Here we report the results of comparative study of different serological and molecular techniques for diagnosis of equine infectious anemia in experimentally inoculated susceptible 9 month old foal. In the experiment, there were used the kits for agar gel immunodiffusion assay (Russia) and ELISA (France) as serological tests, and our own developed test-systems for viral RNA detection by nested reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) with electrophoretic control and by real-time RT-PCR. Developed PCR-tests is based on amplification of EIAV gag-gene fragment using specific oligonucleotide primers. In blood, the viral RNA were detected by both test-systems from 2 day after animal inoculation until the end of observation at 35 day. Specific antibodies were detected in diffuse precipitation reaction from 30 day and in ELISA from 21 day after animal inoculation. Thus, PCR-analysis could be used as an express-test for detecting EIAV genome prior to seroconvertion, and then other diagnostic methods should be further applied to verify the RCR data. The developed Russian test-systems and investigation techniques confirm the benefits of the PCR diagnosis in the early stages of the EIA.

Keywords: equine infectious anemia, experimental infection, PCR, serodiagnostics.

Оформление электронного оттиска