Сельскохозяйственная биология, 2014, № 6, с. 73-80.

УДК 619:616.98:578.835.2:616-079.4

doi: 10.15389/agrobiology.2014.6.73rus

О ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ТЕСТА ПО ВЫЯВЛЕНИЮ СЕКРЕТОРНЫХ IgА ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ОТСУТСТВИЯ ЦИРКУЛЯЦИИ ВИРУСА ЯЩУРА

Д.Н. АФОНИНА, Н.Е. КАМАЛОВА, А.В. КАНЬШИНА, А.М. ТИМИНА

В России среди протективных и превентивных мер против ящура доминирует вакцинопрофилактика. Однако не исключено развитие субклинической инфекции у иммунных животных, которые становятся вирусоносителями и составляют потенциальную угрозу для восприимчивого поголовья. Поэтому разработка и внедрение в практику тестов для выявления животных-ви-русоносителей сохраняют актуальность. Секреторные иммуноглобулины А (sIgA) обеспечивают первую линию защиты против многих возбудителей инфекций, способны ингибировать внутриклеточную репликацию вируса, служат медиатором нейтрализации вирусов. По сообщениям зарубежных авторов, существует возможность идентификации животных-вирусоносителей с помощью экспресс-теста на основе иммуноферментного анализа, выявляющего секреторные IgA (sIgA-ИФА). Ранее нами были определены оптимальные условия sIgA-ИФА для выявления вирусоспецифических sIgA в образцах слюны в одном разведении. В настоящей работе представлены результаты апробации и испытаний тест-системы sIgA-ИФА («сэндвич»-вариант) в сравнении с другими лабораторными методами. Приведены данные исследования биологических образцов от крупного рогатого скота (96 гол., живая масса 200-300 кг, возраст 18-24 мес) из благополучных по ящуру сельскохозяйственных предприятий (Владимирская обл.) до и после вакцинации, иммунизированных различными сериями противоящурной вакцины и подвергнутых экспериментальному заражению. Образцы слюны, сыворотки крови и пищеводно-глоточной жидкости (ПГЖ), полученные с интервалом через 3-4 сут и до 94-х сут после заражения, исследовали с использованием sIgA-ИФА, НБ-ИФА (определение антител к неструктурным белкам вируса), реакции микронейтрализации вируса (РМН) и ПЦР-РВ-анализа. Кроме того, оценили относительную чувствительность, специфичность и точность теста по формулам, рекомендованным International Epizootic Bureau (IEB — Mеждународное эпизоотическое бюро, МЭБ) и сравнили с итогами референтного теста, выполненного Satya Parida (World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease — WRLFMD, Pirbright Institute, Great Britain) по валидированной методике. Из пяти предварительно иммунизированных и затем инфицированных животных без клинических проявлений патологии у одного (№ 8895) наличие sIgA с помощью sIgA-ИФА выявили в образце слюны на 18-е сут после заражения при ПП (процент позитивности) = 53,00±0,05 % и в последующие сроки (с 21-х до 94-х сут) — при значениях ПП от 41,00±0,11 до 115,00±0,41 %. Полученные данные были подтверждены в РМН (титр sIgA на 18-е сут — 1,20±0,05 lg, в период с 21-х по 46-е сут — до 1,58±0,08-1,90±0,13 lg). При этом в РМН отмечали существенные колебания значений, что нежелательно для идентификационного теста. В НБ-ИФА результаты обнаружения антител к неструктурным белкам ВЯ с 18-х по 94-е сут были положительными. В ПЦР РНК ВЯ выявляли в пробах ПГЖ с 28-х по 60-е сут после экспериментального заражения, но sIgA-ИФА давал более однозначные результаты, чем ПЦР. Для другого животного (№ 8898) также подтверждена скрытая форма инфекции. Таким образом, показано, что предложенная тест-сис-тема на основе непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения sIgА к вирусу ящура в образцах слюны крупного рогатого скота по диагностическим характеристикам позволяет идентифицировать животных-вирусоносителей. По результатам исследования 91 образца слюны чувствительность разработанной тест-системы относительно референтной (WRLFMD) составила 100 %, относительная специфичность — 97,7 %, точность — 99,0 %. На основании параметров κ-статистики (κ = 0,99) подтверждена высокая сходимость результатов для двух тест-систем.

Ключевые слова: ящур, секреторный иммуноглобулин А, иммуноферментный анализ, вирусоносительство, поствакцинальный контроль.

Полный текст

DIAGNOSTIC VALUE OF A TEST FOR DETECTION OF SECRETORY IgA FOR CONFIRMATION OF ABSENCE OF FMD VIRUS CIRCULATION

In Russia the preventive vaccination dominates over other protective and preventive measures against foot and mouth disease (FMD). However, the development of the subclinical infection in immune animals should not be ruled out as these animals become virus carriers and pose a potential threat for susceptible animal population. Therefore, the design and reduction to practice of tests for identification of virus-carrier animals continues to be relevant. Secretory immunoglobulins A (sIgA) provide the first line of protection against many infectious agents, they are capable of inhibiting virus intracellular replication and serve as a transmitter of virus neutralization. As reported by foreign authors there is a possibility to identify virus-carrier animals using a rapid ELISA-based test detecting secretory IgA (sIgA-ELISA). Previously we determined sIgA-ELISA optimal conditions for detection virus-specific sIgA in saliva samples in one dilution. In the given paper results of validation and evaluation of the sIgA-ELISA test-system («sandwich» ELISA) are shown as compared with other laboratory methods. The paper presents data on testing bovine biological samples (96 animals with body weight of 200-300 kg at the age of 18-24 months) from FMD-free agricultural enterprises (Vladimir Oblast) collected before and after vaccination from animals, immunized with different batches of FMD vaccine and subject to experimental infection. Samples of saliva, blood sera and esopharyngeal fluid collected with an interval of 3-4 days and up to 94 days after infection were tested using sIgA-ELISA, NP-ELISA (detection of antibodies to virus nonstructural proteins), microneutralization test and Real-Time PCR. Besides, relative sensitivity, specificity and accuracy of the test was evaluated using formulae recommended by the World Organisation for Animal Health (OIE) and compared with results of a reference test conducted by Satya Parida (World Reference Laboratory for Foot and Mouth Disease — WRL, Pirbright Institute, Great Britain) according to a validated method. Out of five preliminary immunized and then infected animals without clinical signs one animal (№ 8895) demonstrated the presence of sIgA in saliva in sIgA-ELISA on day 18 after infection at PP (positivity percent) = 53.00±0.05 % and at other dates (from 21 to 94 days) — at PP from 41.00±0.11 to 115.00±0.41 %. The obtained results were confirmed using the microneutralization test (sIgA titer on day 18 was 1.20±0.05 lg, during a period from day 21 to day 46 the titer was 1.58±0.08-1.90±0.13 lg). At that, the microneutralization test showed significant variations in values and it is undesirable for an identification test. Results of detecting antibibodies to FMD virus nonstructural proteins on day 18-94 were positive. FMD virus RNA was detected using PCR in esopharyngeal fluid samples during a period from day 28 to day 60 after experimental infection, but sIgA-ELISA showed more unambiguous results as compared with PCR. A latent infection was also confirmed in the other animal (№ 8898). Thus, it was demonstrated that the suggested test-system on the basis of indirect «sandwich» ELISA for detection of sIgA to FMD virus in bovine saliva samples made it possible to identify virus-carrier animals according to diagnostic characteristics. After considering results of testing 91 saliva samples the sensitivity of the developed test-system as compared with the reference one (WRL) was 100 %, relative specificity — 97.7 %, accuracy — 99.0 %. The high reproducibility of two test-systems was confirmed on the basis of κ-statistics (κ = 0.99).

Keywords: foot and mouth disease, secretory immunoglobulin A, solid phase immunosorbent assay, virus carrier state, post-vaccination control.

Оформление электронного оттиска