Сельскохозяйственная биология, 2010, № 6, с. 26-29.

УДК 638.12:631.523:577.212:57.088

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОРОД И ПОПУЛЯЦИЙ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПЦР

Н.И. КРИВЦОВ¹, И.И. ГОРЯЧЕВА², И.Г. УДИНА², А.В. БОРОДАЧЕВ¹, М.А. МОНАХОВА³

Впервые проведено исследование генетической структуры коллекционных пчелиных семей племенных пасек методом ПЦР. Выявлена высокая степень чистопородности исследованных пчел по материнской линии. Определены пчелиные семьи, которые могут быть использованы для разработки критериев генетической паспортизации среднерусской породы пчел.

Необходимость интенсификации селекционной работы в пчеловодстве и сохранения биологического разнообразия пчел требует разработки современных подходов для изучения и мобилизации имеющихся генетических ресурсов. Комплексное исследование перспектив использования потомства пчелиных семей в селекционном процессе может быть выполнено на основании анализа морфометрических и молекулярно-генетических признаков. Классический морфометрический анализ позволяет определить породную принадлежность пчел, а его сочетание с молекулярно-генетическими характеристиками дает возможность оценивать чистопородность пчелиных семей (прежде всего, пчелиных маток).

Аборигенная для большей части территории России среднерусская порода пчел уникально приспособлена к суровым местным климатическим условиям и проявляет ряд ценных хозяйственных признаков, несвойственных другим породам, — зимостойкость, высокую яйценоскость маток, устойчивость к ряду заболеваний. Именно эта порода служит базовой для селекции пчел в Центральной и Северной России, в связи с чем оценка чистопородности пчелиных семей племенных пасек представляется исключительно важной. Для такой оценки пчел по материнской линии целесообразно исследовать маркерную область митохондриального генома Apis mellifera — АТ-богатый межгенный локус, расположенный между генами субъединиц I и II цитохромоксидазы (COI-COII). У пчел среднерусской породы эта область образована 3'-концом гена цитохромоксидазы I—геном тРНКLeu—элементом P—двумя элементами Q—5'-концом гена цитохромок-сидазы II. Элемент Р имеет длину 54 п.н. и полностью состоит из нуклеотидов А + Т; размер элемента Q — 196 п.н., содержание А + Т — 93,4 %. Общая длина локуса составляет приблизительно 600 п.н. (1). У пчел южных пород (серая горная кавказская, желтая кавказская, карпатская) в этом межгенном локусе обнаруживается только один элемент Q, а сам участок имеет размер около 300 п.н. Ранее исследование структуры межгенного локуса COI-COII в России проводилось в популяциях пчел Южного Урала для оценки чистопородности башкирских бортевых и пасечных пчел (2, 3).

Целью нашей работы было изучение чистопородности пчелиных семей на племенных пасеках для оценки перспектив использования этих семей при разработке критериев генетической паспортизации среднерусской породы. 

Методика. Материалом для исследования послужили пчелы Apis melliferaL. среднерусской породы (Орловская опытная станция пчеловодства НИИ пчеловодства). Наряду с ними были изучены пчелиные семьи из популяций среднерусской породы из Орловской, Кемеровской, Вологодской областей, Пермского и Красноярского краев, а также республик Башкортостан, Татарстан, Марий-Эл, Алтайской. Для сравнения были проанализированы пчелы майкопского породного типа карпатской породы.

ДНК получали с использованием коммерческого набора для выделения ДНК («Изоген», Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) были разработаны оригинальные праймеры, специфичные соответственно к 3'-концу гена СOI и 5'-концу гена COII. ПЦР выполняли с использованием набора для амплификации Encyclo PCR kit («Евроген», Россия) в следующем режиме: начальная денатурация — 95 °С, 2 мин; 35 циклов, включающих денатурацию (95 °С, 15 с), отжиг праймеров (58 °С, 15 с) и полимеризацию (72 °С, 40 с); заключительная полимеризация — 72 °С, 4 мин. Электрофорез продуктов амплификации осуществляли в 1 % агарозном геле, очистку ПЦР-продукта перед секвенированием выполняли с помощью набора для элюции JetQuiq Elution Kit («Genomed», Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems (США) с обоих праймеров .

Результаты. Среднерусская порода пчел, расселившаяся на значительной территории, представлена рядом локальных популяций. Широко применяемый анализ экстерьерных признаков пчел для определения их чистопородности обеспечивает выявление различий между породами, но исключает такую возможность в отношении популяций внутри породы (табл.). Большинство различий по традиционным экстерьерным признакам (морфологические промеры) недостоверны и укладываются в пределы сезонных колебаний, поэтому мало пригодны для идентификации локальных популяций и могут быть использовать лишь для дифференциации подвидов (пород), в частности среднерусской и карпатской пчелы.

В свою очередь, представляется перспективным применение молекулярно-генетических методов для идентификации локальных популяций, поскольку полученные с помощью таких методов результаты в меньшей степени зависят от условий внешней среды и позволяют более точно оценивать таксономическую принадлежность объекта.

В результате амплификации ПЦР-продукт получили для всех изученных образцов. При анализе ДНК пчел среднерусской породы были обнаружены фрагменты длиной не менее 600 п.н., что однозначно свидетельствует о чистопородности исследованных пчелиных семей по материнской линии. Кроме того, на основании структуры изучаемого фрагмента была выявлена генетическая дифференциация породы. В 30 % пчелиных семей, представляющих популяции из Вологодской области и Пермского края, республик Татарстан и Башкортостан, были обнаружены более длинные фрагменты (около 800 п.н. и 1000 п.н.) межгенного локуса COI-COII митохондриальной ДНК (мтДНК) (рис.). В литературе описана структура первого из названных «тяжелых» вариантов митохондриального гаплотипа. Он образован за счет повторения элемента Q и имеет структуру PQQ (1). Секвенирование продуктов амплификации длиной 600 п.н. и сравнение их с базой данных GenBank (EF676104) не выявило каких-либо мутаций в изучаемых последовательностях. У всех пчел породного типа майкопский карпатской породы, как и ожидалось, был обнаружен фрагмент длиной около 300 п.н.

Электрофорез продуктов амплификации области COI-COII в агарозном геле: 1-8 — образцы из Татарстана; 9-10 — образцы из Кемеровской области; 11-12 — образцы из Вологодской области; 13-15 — образец из Орловской области; 16 — маркер молекулярной массы М100. Стрелками отмечена локализация ожидаемых ПЦР-фрагментов: А — 300 п.н., В — 600 п.н., С — 1000 п.н.

Анализ полиморфизма длины межгенного локуса COI-COII митохондриальной ДНК пчел племенных па-сек Орловской опытной станции, охвативший 10 % пчелиных семей, свидетельствует о чистопородности среднерусских пчел по материнской линии. При анализе маркерного локуса мтДНК не было выявлено митохондриальных вариантов, характерных для пчел южных пород.

Исследования митохондриальной ДНК A. mellifera были начаты около 20 лет назад (1). Сейчас на основе маркерных областей генома митохондрий осуществляется оценка уровня разнообразия в коммерческих популяциях пчел (4), уточнение биогеографии подвидов (5), установление популяционно-генетической структуры (6, 7), изучение процессов гибридизации подвидов и интродукции видов пчел (8-10). В ряде случаев проводится совместный анализ особенностей митохондриальной ДНК и микросателлитов (4).

Определение структуры COI-COII представляет собой первый и необходимый этап разработки критериев генетической паспортизации пород пчел России. В настоящее время генетическая паспортизации приобретает особое значение в связи с тем, что основным направлением современного пчеловодства является формирование и поддержание материнских и отцовских линий с последующими межлинейными скрещиваниями с помощью инструментального осеменения и отбор эффективных комбинаций среди межлинейных гибридов. Создание генетического паспорта породы, а также индивидуальная паспортизация особо ценных производителей позволит повысить эффективность селекционно-племенной работы в пчеловодстве.

Таким образом, исследование генетической структуры коллекционных пчелиных семей, проведенное с помощью метода ПЦР на племенных пасеках, выявило высокую степень чистопородности исследованных пчел по материнской линии. Определены пчелиные семьи, которые могут быть использованы для разработки критериев генетической паспортизации среднерусской породы пчел.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. C o r n u e t  J.M.,  G a r n e r y  L.,  S o l i g n a c  M. Putative origin and function of the intergenic region between COI and COII of Apis mellifera L. mitochondrial DNA. Genetics,  1991, 128(2): 393-403.
2. Н и к о н о р о в  Ю.М.,  Б е н ь к о в с к а я  Г.В.,  П о с к р я к о в  А.В. и др. Использование метода ПЦР для контроля чистопородности пчелосемей Apis mellifera mellifera L. в условиях Южного Урала. Генетика, 1998, 34(11): 1574-1577.
3. Н и к о л е н к о  А.Г.,  П о с к р я к о в  А.В. Полиморфизм локуса COI-COII митохондриальной ДНК медоносной пчелы Apismellifera L. на Южном Урале. Генетика, 2002, 38(4): 458-462.
4. И л ь я с о в  Р.А.,  П е т у х о в  А.В.,  П о с к р я к о в  А.В.,  Н и к о л е н к о  А.Г. Локальные популяции Apismelliferamellifera L. на Урале. Генетика, 2007, 43(6): 855-858.
5. C h a p m a n  N.C.,  L i m  J.,  O l d r o y d  B.P. Population genetics of commercial and feral honey bees in Western Australia. J. Econ. Entomol., 2008, 101: 272-277.
6. S t e v a n o v i c  J.,  S t a n i m i r o v i c  Z.,  R a d a k o v i c  M.,  K o v a c e v i c  S.R. Biogeographic study of the honey bee (Apis mellifera L.) from Serbia, Bosnia and Herzegovina and Republic of Macedonia based on mitochondrial DNA analyses. Genetika, 2010, 46: 685-691 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20583605).
7. D e  l a  R ú a  P.,  G a l i á n  J.,  S e r r a n o  J.,  M o r i t z  R.F. Genetic structure and distinctness of Apis mellifera L. populations from the Canary Islands. Mol. Ecol., 2001, 10(7): 1733-1742.
8. P a l m e r  M.R.,  S m i t h  D.R.,  K a f t a n o g l u  O. Turkish honeybee: genetic variation and evidence for a fourth lineage of Apis mellifera mtDNA. J. Heredity, 2000, 91: 42-46.
9. F r a n c k  P.,  G a r n e r y  L.,  C e l e b r a n o  G.,  S o l i g n a c  M.,  C o r n u e t  J.-M. Hybrid origin of honeybees from Italy (Apis mellifera ligustica) and Sicily (A. m. sicula). Mol. Ecol., 2000, 9(7): 907-921.
10. K r a u s  F.B.,  F r a n c k  P.,  V a n d a m e  R. Asymmetric introgression of African genes in honeybee populations (Apis mellifera L.) in Central Mexico. Heredity, 2007, 99: 233-240.
11. C o l l e t  T.,  F e r r e i r a  K.M.,  A r i a s  M.C.,  S o a r e s  A.E.,  D e l  L a m a   M.A.  Genetic structure of Africanized honeybee populations (Apis mellifera L.) from Brazil and Uruguay viewed through mitochondrial DNA COI-COII patterns. Heredity, 2006, 97(5): 329-335.

IDENTIFICATION OF RACE AND POPULATIONS OF HONEY-BEE WITH THE USE OF PCR-METHOD

N.I. Krivtsov¹, I.I. Goryacheva², I.G. Udina², A.V. Borodachev¹, M.A. Monakhova³

For the first time the authors made the molecular-biological investigation of genotypic structure in collection honey-bee colonies from pedigree apiaries. The high degree of purebred investigated honey-bee on mother line was revealed. The bee-families were determined, which can be used for a development of criteria of genetic passports of Central Russian breed of honey-bee.

Оформление электронного оттиска