УДК 636.2:631.523:575:576.08
ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ПАРАТИПИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА
Т.Т. ГЛАЗКО1, Ю.А. СТОЛПОВСКИЙ2, В.И. ГЛАЗКО1
Выполняли сравнительный анализ частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови у монгольского местного крупного рогатого скота и яков, разводимых в разных эколого-географических районах Монголии, а также у их межвидовых гибридов. Показано, что на частоту цитогенетических аномалий существенно влияет возраст животного, условия окружающей среды, видовая принадлежность. Обнаружено, что у межвидовых гибридов доля эритроцитов с микроядрами в 2-3 раза выше, чем у животных родительских видов в тех же возрастных группах и условиях среды. Делается вывод о необходимости учета рассмотренных эндо- и экзогенных факторов, влияющих на результаты микроядерного теста, при его использовании для биоиндикации экотоксического загрязнения среды обитания сельскохозяйственных видов животных и источников продовольствия животного происхождения.
Ключевые слова: цитогенетические аномалии, микроядерный тест, межвидовые гибриды, эколого-гографические факторы.
Рост загрязненности окружающей среды генотоксикантами приводит к необходимости поиска методов их контроля, поскольку полученные в таких условиях продукты питания могут быть небезопасными для человека. Традиционные методы на основе определения содержания загрязняющих веществ разработаны только для ограниченного числа токсикантов и не учитывают возможность их кумулятивного действия на биологические объекты. Следовательно, требуется разрабатывать методы индикации общих экотоксических эффектов с использованием биоиндикаторных видов млекопитающих, что особенно важно для тестирования безопасности условий производства продовольствия. В качестве таких биоиндикаторов служат сельскохозяйственные виды животных (1, 2), поскольку они контактируют с теми же факторами среды, что и человек, одновременно являясь источником продовольственных ресурсов.
При оценке экотоксических эффектов обычно рассчитывают частоту встречаемости различных типов цитогенетических аномалий в клетках крови — показателя, наиболее доступного и подходящего для анализа биологического материала.
Как правило, при определении генотоксических эффектов в клетках периферической крови анализируют частоту цитогенетических аномалий в метафазных пластинках (полиплоидные, анеуплоидные клетки, метафазы с различными типами хромосомных аберраций). Однако при подобном подходе необходимо культивирование в питательной среде с добавлением стимуляторов клеточного деления и антибиотиков, поскольку клетки периферической крови спонтанно делятся очень редко. Такая предварительная обработка может искажать результаты оценки исходных мутационных спектров, потенциально индуцируя дополнительные мутации, и, кроме того, требует больше времени и ресурсов. Поэтому использование с подобной целью различных вариантов микроядерного теста более перспективно.
В настоящее время достаточно широко применяют три основных варианта микроядерного теста: в безъядерных эритроцитах (3), в одноядерных лимфоцитах и буккальном эпителии, а также в двуядерных лимфоцитах с индуцированным блоком цитокинеза (4-6). Однако чтобы использовать микроядерный тест для биоиндикации экотоксических воздействий, необходимо располагать данными о спонтанной частоте образования микроядер в клетках периферической крови, а также о факторах, влияющих на результат этого теста. Очевидно, что, кроме экзогенных генотоксинов, на анализируемый показатель могут оказывать влияние генотипические особенности исследуемых животных, что нужно учитывать при использовании сельскохозяйственных видов в качестве биоиндикаторов. Так, показаны выраженные межвидовые различия по частоте формирования микроядер при воздействии ионизирующего облучения (7). Наиболее близкие значения, характеризующие увеличение числа клеток с микроядрами в ответ на облучение одними и теми же дозами, отмечали у человека, крупного рогатого скота и коз, самыми резистентными оказались птицы и рыбы, а кролики и свиньи занимали промежуточное положение. В этой связи авторы полагают, что крупный рогатый скот и козы могут эффективно использоваться в качестве биоиндикаторных видов для оценки генотоксического загрязнения окружающей среды. В то же время имеются данные о выраженных генетически детерминированных внутривидовых различиях по частоте клеток с микроядрами (8). В наших исследованиях ранее были выявлены различия между породами крупного рогатого скота в зависимости от направления продуктивности (9). Обнаружено также, что относительно повышенная частота клеток с микроядрами наблюдается у межвидовых гибридов (2).
Мы сравнили влияние возраста, видовой принадлежности, межвидовой гибридизации и условий обитания на показатели микроядерного теста у крупного рогатого скота, яков и их межвидовых гибридов.
Методика. В 2009-2010 годах выполняли исследования мазков периферической крови местного монгольского крупного рогатого скота (13 гол.) и яков (14 гол.) в возрасте 3-6 лет из разных эколого-географических регионов Монголии (северо-запад Монголии, район Хубсугул, биосферный заповедник; юг Монголии, район, примыкающий к пустыне Гоби, зона рискованного животноводства), а также 2-месячных телят местного мон-гольского крупного рогатого скота (4 гол.) и межвидовых гибридов (хай-наки — потомки скрещивания коров и яков, 7 гол.), выращиваемых фер-мерами в районе Хубсугул (материал собран в экспедиции 2008 года).
При приготовлении мазков на предметном стекле каплю перифе-рической крови смешивали с каплей физиологического раствора, равномерно распределяли, высушивали, фиксировали метиловым спиртом в течение 30 мин и окрашивали красителем Гимза («Merk», Германия). Число эритроцитов с микроядрами определяли для 3000 клеток и выражали в расчете на 1000 клеток (‰). Препараты исследовали под бинокулярным микроскопом («Motik», Китай) со встроенным цифровым фотоаппаратом (увеличение x1000).
Статистическую достоверность межгрупповых различий оценивали по t-критерию Стьюдента (tS).
Результаты. Наименьшую частоту эритроцитов с микроядрами (табл.) выявили у яков и местного монгольского крупного рогатого скота из зоны рискованного животноводства, примыкающей к пустыне Гоби (соответственно 0,3±0,2 и 1,8±0,6 ‰). У крупного рогатого скота по сравнению с яками обнаруживаются несколько сниженные частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами, и эти частоты существенно ниже, чем у ранее исследованных нами пород крупного рогатого скота разных направлений продуктивности (9, 10).
Частота эритроцитов с микроядрами была достоверно выше (P < 0,05) у животных обоих видов в более благоприятных условиях разведения в районе Хубсугул (яки — 3,2±0,6 ‰, крупный рогатый скот — 4,6±0,7 ‰). Величина показателя у исследованной группы местного монгольского скота в районе Хубсугула оказалась близкой к типичной для мясного скота, исследованного нами ранее (9, 10). Межвидовые различия в этом регионе были менее выраженными.
| Частота эритроцитов с микро-ядрами в периферической крови у скота из разных эколого-гео-графических регионов Монголии (2008 год) | ||
Вид, |
Показатель, ‰ |
Среднее |
Р а й о н Х у б с у г у л |
||
Хайнаки |
8,0 (104) |
10,0±1,1 |
КРС: |
|
|
взрослые особи 4,5 (77) |
4,6±0,7 |
|
|
1,0 (78) |
|
|
5,0 (79) |
|
|
3,5 (80) |
|
|
6,5 (81) |
|
|
6,0 (82) |
|
|
6,0 (83) |
|
телята |
12,0 (68) |
9,5±1,1 |
|
10,5 (69) |
|
|
8,0 (70) |
|
|
7,5 (71) |
|
Яки |
1,3 (55) |
3,2±0,6 |
Р а й о н Г о б и |
||
КРС |
2,0 (111) |
1,8±0,6 |
|
0,3 (112) |
|
|
1,0 (113) |
|
|
3,0 (114) |
|
|
1,0 (117) |
|
|
0,3 (118) |
|
|
4,6 (122) |
|
Яки |
0,6 (161) |
0,3±0,2 |
|
0 (162) |
|
|
0 (163) |
|
|
1,3 (164) |
|
|
0 (165) |
|
|
0 (166) |
|
|
0 (167) |
|
П р и м е ч а н и е. КРС — крупный рогатый скот. |
||
Полученные данные свидетельствуют о тенденции к относительному снижению стабильности хромосомного аппарата у местного монгольского крупного рогатого скота по сравнению с яками.
Статистически достоверные различия по частоте эритроцитов с микроядрами в периферической крови в группах животных обоих видов из разных мест обитания позволяют утверждать, что яки и крупный рогатый скот в зоне рискованного животноводства (при интенсивном давлении естественного отбора) отличаются от представителей тех же видов, обитающих в более благоприятных условиях, относительно повышенной стабильностью хромосомного аппарата. Можно ожидать, что такие различия представляют собой результат влияния естественного отбора на повышенную устойчивость животных к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.
Ранее мы получили результаты, свидетельствующие о выраженных различиях по частоте цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у пород крупного рогатого скота, принадлежащих к разным направлениям продуктивности (10), что указывало на наличие достаточно выраженной генетической компоненты в изменчивости по стабильности хромосомного аппарата.
В литературе имеется много данных об индивидуальной изменчивости крупного рогатого скота внутри породы по частоте цитогенетических аномалий в клетках крови (12, 13), о связи между анеуплоидией лимфоцитов и сниженной устойчивостью плазматических мембран эритроцитов к кислотной обработке, а также между частотой цитогенетических аномалий и подавлением воспроизводительной способности животных (13, 14). Связь между частотой цитогенетических аномалий в клетках периферической крови и воспроизводительной функцией выявлена и у человека (15).
Вследствие особого значения показателей уменьшения стабильности хромосомного аппарата не только для биоиндикации генотоксических воздействий, но и для прогноза воспроизводительной функции животных актуальным представляется выяснение возможного влияния генетической компоненты изменчивости частоты цитогенетических аномалий в соматических клетках животных на результаты микроядерного теста. При оценке этого влияния мы сравнили частоту эритроцитов с микроядрами у половозрелых (3-6 лет) животных местного монгольского крупного рогатого скота, яков и их межвидовых гибридов (хайнаков), содержавшихся в одинаковых условиях биосферного заповедника на северо-западе Монголии в районе Хубсугул. Такие межвидовые гибриды бесплодны, однако у них отсутствуют фенотипически выраженные нарушения развития.
Как оказалось (см. табл.), у хайнаков анализируемый показатель статистически достоверно (P < 0,01) превышал регистрируемый у местного крупного рогатого скота (10,0±1,1 против 4,6±0,7 ‰) и яков (10,0±1,1 против 3,2±0,6 ‰). То есть в одинаковых возрастных группах и условиях окружающей среды частота эритроцитов с микроядрами у межвидовых гибридов была в 2-3 раза выше, чем у родителей. Судя по полученным данным, генетическая компонента изменчивости частоты цитогенетических аномалий в соматических клетках может существенно влиять на результаты оценки нестабильности хромосомного аппарата у животных, что необходимо учитывать при использовании таких характеристик в качестве биоиндикаторных показателей экзогенного генотоксическиго эффекта.
Таким образом, результаты оценки нестабильности хромосомного аппарата, полученные на основании частоты эритроцитов с микроядрами в периферической крови, зависят от ряда параметров, в частности возраста и видовой принадлежности животных, а также интенсивности действия факторов естественного отбора, направленного на повышение устойчивости к неблагоприятным внешним агентам. Существенный вклад в варьирование результатов микроядерного теста может вносить генетическая компонента (судя по 2-3-кратному превышению показателей у межвидовых гибридов по сравнению с таковыми у животных родительских видов в тех же возрастных группах и условиях среды). Влияние перечисленных факторов необходимо учитывать при использовании частоты цитогенетических аномалий в соматических клетках животных для биоиндикации экотоксических загрязнений среды обитания и источников продовольствия животного происхождения.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. P i e š o v á E., Š i v i k o v á K. The induction of micronuclei in bovine lymphocytes by exposure to benzene and S-9 mix. Ann. Agric. Environ. Med., 2003, 10: 261-263.
2. K a d m i r i M., G l o u i b K., V e r s c h a e v e L., H i l a l i A. Cytogenetic monitoring of domestic mammals exposed to wastewaters from the localities of Dladla and Boukallou near Settat, Morocco. Environ. Int., 2006, 32(5): 690-696.
3. B a l o d e Z. Assessment of radio-frequency electromagnetic radiation by the micronucleus test in bovine peripheral erythrocytes. Sci. Total Environ., 1996, 180(1): 81-85.
4. K i r s c h - V o l d e r s M., F e n e c h M. Inclusion of micronuclei in non-divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a more comprehensive cytokinesis block micronucleus assay for biomonitoring purposes. Mutagenesis, 2001, 16(1): 51-58.
5. F e n e c h M. Cytokinesis-block micronucleus assay evolves into a «cytome» assay of chromosomal instability, mitotic dysfunction and cell death. Mutat. Res., 2006, 600(1-2): 58-66.
6. B o n a s s i S., B i a s o t t i B., K i r s c h - V o l d e r s M. e.a. HUMNXL Project Consortium. State of the art survey of the buccal micronucleus assay — a first stage in the HUMN(XL) project initiative. Mutagenesis, 2009, 24(4): 295-302.
7. K i m S.R., K i m T.H., R y u S.Y. e.a. Measurement of micronuclei by cytokinesis-block method in human, cattle, goat, pig, rabbit, chicken and fish peripheral blood lymphocytes irradiated in vitro with gamma radiation. In Vivo, 2003, 17(5): 433-438.
8. D h i l l o n V., T h o m a s P., F e n e c h M. Effect of common polymorphisms in folate uptake and metabolism genes on frequency of micronucleated lymphocytes in a South Australian cohort. Mutat. Res., 2009, 665(1-2): 1-6.
9. Г л а з к о Т.Т., Д у б и ц к и й С.Е., К о с о в с к и й Г.Ю. Частоты встречаемости цитогенетических аномалий в клетках крови крупного рогатого скота разных направлений продуктивности при действии низких доз ионизирующего излучения. С.-х. биол., 2007, 6: 58-63.
10. Г л а з к о Т.Т., С а ф о н о в а Н.А. Меж- и внутрипородная цитогенетическая нестабильность у крупного рогатого скота. Зб. наукових праць Інституту агроекології та біотехнології УААН «Агроекологія і біотехнологія» (Київ), 2000, 4: 198-209.
11. С е м е н о в а О.Н. Изменения гематологических, цитогенетических и иммунологических показателей у крупного рогатого скота при лейкозе на фоне анаплазмозной инвазии. Канд. дис. Новосибирск, 2004.
12. С е м е н о в А.С., Б а к а й Ф.Р. Биохимические и гематологические исследования крови голштинизированных коров. Естественные науки, 2009, 2: 186-189.
13. Б а к а й Ф.Р., С е м е н о в А.С. Анеуплоидия у голштинизированного крупного рогатого скота в связи с показателями воспроизводительной способности. Естественные науки, 2009, 2: 189-193.
14. R u b e s J., H o r i n o v a Z., G u s t a v s o n I., B o r k o v e c L., U r b a n o v a J. Somatic chromosome mutations and morphological abnormalities in sperms of boars. Hereditas, 1991, 115: 139-143.
15. M i g l i o r e L., C o l o g n a t o R., N a c c a r a t i A.,
B e r g a m a s c h i E. Relationship between genotoxicity biomarkers in somatic and germ cells: findings from a biomonitoring study. Mutagenesis, 2006, 21(2): 149-152.
GENOTYPIC AND PARATYPIC FACTORS INFLUENCING ON THE MICRONUCLEI TEST RESULTS
T.T. Glazko1, Yu.A. Stolpovskii2, V.I. Glazko1
Comparative analysis of the erythrocyte frequencies with micronuclei in peripheral blood of the Mongolian indigenous cattle breed and the yaks breeding in different ecologic-geographical areas of Mongolia, and also interspecies hybrids between them was carried out. It was shown that on the frequencies of erythrocytes with micronuclei essential influences was rendered by age of animals, environment condition, and species accessory. It was revealed that in interspecies hybrids the frequency of erythrocytes with micronuclei in 2-3 times above, than in animals of parental species in the same age groups and environment conditions. The necessity to include in consideration of the micronuclei test results the influences of the external and internal factors was concluded at the using the erythrocyte frequencies with micronuclei for bioindication of ecotoxic pollution of the inhabitancy of agricultural animal species and sources of the foodstuffs of an animal origin.
Key words: cytogenetic animalies, micronuclei test, interspecies hybrids, ecology-geogra-phical factors.
1ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный |
Поступила в редакцию |
