УДК 636.5:614.47:578:57.083

МЕМБРАННОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ВИРУССОДЕРЖЩЕЙ СУСПЕНЗИИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ВАКЦИН ПРОТИВ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦЫ

Т.А. СКОТНИКОВА, Э.Ф. ТОКАРИК, А.Я. САМУЙЛЕНКО

На инфицированной аллантоисной жидкости развивающихся куриных эмбрионов исследовали эффективность микрофильтрационных методов (применение ядерных и фторопластовых мембран, ультрафильтрация на полых волокнах) очистки и концентрирования вируса ньюкаслской болезни (штамм Ла-Сота). Метод концентрирования ультрафильтрацией на полых волокнах обеспечивал получение вируса, обладающего высокой биологической активностью, что позволило использовать его в качестве основного компонента ассоциированной вакцины против вирусных болезней птицы — ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита.

Ключевые слова: ультрафильтрация, мембраны, разделение, концентрирование, очистка, вирус ньюкаслской болезни, ассоциированные вакцины.

 

Ньюкаслская болезнь (НБ) согласно классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) относится к Перечню особо опасных инфекций, включающему 78 нозоединиц, о появлении которых любая страна должна срочно информировать МЭБ. Несмотря на успехи в эпизоотологии, диагностике и исследованиях патогенности вируса на молекулярном уровне, НБ остается одной из наиболее опасных болезней птиц. В 2006-2007 годах новые вспышки и эпизоотии были зафиксированы в странах, благополучных по НБ в течение длительного периода (1). В 2007 году на 17 территориях Российской Федерации отмечено 36 неблагополучных по НБ пунктов (распространение заболевания среди кур и голубей), неблагополучными также были Франция, Финляндия, Греция, Словакия, Болгария, Румыния, Сербия, Турция, Япония (2). Практически ежемесячные вспышки НБ отмечали в Бразилии, Украине, Эстонии. Доля регистрируемых случаев ньюкаслской болезни в РФ за 2007 год составила 9,13 % от числа всех инфекционных заболеваний птицы (3). Динамический прогноз на 2006-2010 годы предусматривает превышение тренда инцидентности вспышек НБ (1).

В Российской Федерации 50 % от общего объема производства биопрепаратов составляют вакцины для птицы, из них на долю вакцин для профилактики ньюкаслской болезни приходится около 23 %. Отечественные производители выпускают живые вакцины из штаммов В1, Ла-Сота, Бор-74, Н, ГАМ-61. Кроме того, на рынке присутствуют импортные вакцины из штаммов Ла-Сота, Clon-30, Ulster-2C. Вирус НБ служит обязательным компонентом большинства ассоциированных (живых и инактивированных) вакцин против болезней птицы. Наиболее часто используются ассоциации вирусов НБ и инфекционного бронхита кур, болезни Гамборо, синдрома снижения яйценоскости, инфекционного ларинготрахеита.

Материал для изготовления вакцин против НБ традиционно получают посредством накопления вируса в эмбриональной жидкости, поэтому на долю вирусного белка приходится не более 0,1 % от его общего содержания. Основной иммунологический компонент профилактических препаратов должен быть по возможности свободен от сопутствующих белков (иммуногенов), так как их наличие в вакцине может привести к развитию аллергических или сенсибилизационных реакций организма. Общей схемы очистки и концентрирования вирусов не существует (4), но подбор оптимальных методов для осуществления этих процессов очень важен, поскольку позволяет получить более эффективные и безопасные препараты.

В наши задачи входила разработка технологического процесса очистки и концентрирования вируса ньюкаслской болезни (штамм Ла-Сота) с применением методов мембранного разделения, а также изучение возможности использования концентрированного вируса для конструирования ассоциированных вакцин.

Методика. Исследования проводили на аллантоисной жидкости развивающихся куриных эмбрионов (РЭК), содержащей вирус ньюкаслской болезни (штамм Ла-Сота).

Для очистки и концентрирования вируссодержащего материала (ВСМ) использовали ядерные мембраны (ЯМ; диаметр пор 0,05-0,08 мкм),  фторопластовые мембраны (МФФ; 0,05-0,08 мкм) и полые волокна (ПВ; 0,02 мкм). Мембраны и волокна испытывали по отдельности. Предварительную очистку ВСМ от механических крупнодисперсных примесей осуществляли на установке УСФ-293-7 («ОКБ тонкого биологического машиностроения», Россия) с применением картона фильтровального для биологических жидкостей (КФБЖ), ультрафильтрацию на полых волокнах (ВПУ-15ПА) выполняли на установке УПВ-6,0 («ОКБ тонкого биологического машиностроения», Россия). Мембраны ЯМ и МФФ испытывали в ультрафильтрационных установках ФМ-02-200 и ФМ-02-1000 с перемешиванием.

Необходимую продолжительность культивирования развивающихся куриных эмбрионов перед отбором вируссодержацего материала устанавливали, исходя из максимальной инфекционной активности вируса, наименьшего количества белка в ВСМ и наибольшего объема эмбриональной жидкости, полученной с одного эмбриона. Эффективность мембран оценивали по кратности концентрирования препарата (измеряя объем фильтрата в мерном сосуде на выходе из ультрафильтрационной установки), величине и стабильности биологической активности вируса в концентрате ВСМ, степени очистки материала по белку, скорости фильтрации, селективности и технологичности. Кроме того, изучали влияние срока хранения ВСМ после сбора на характеристики жидкого концентрата.

Количество белка определяли спектрофотометрически (l = 280 нм) и по методу Лоури (5), инфекционную активность вируса — титрованием на 9-11-суточных РЭК с последующей постановкой реакции гемагглютинации (РГА), гемагглютинирующую активность вируса (ГАА) — в РГА в объеме 0,2 мл с использованием 1 % суспензии формалинизированных эритроцитов (6).

Полученный концентрат вируса исследовали на электронном микроскопе JEM-100B (Япония). Процесс разделения вирусного материала контролировали гель-фильтрацией проб исходного ВСМ, концентрата и фильтрата. Гель-хроматограммы получали с использованием геля Toypearl HW-50 F1 («Toyo», Япония) на колонке 2,6x40,0 см; элюирование проводили 0,15 М фосфатным буфером (рН 7,2). 

Очищенный и концентрированный вируссодержащий материал использовали для конструирования ассоциированной живой вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц. Соотношение вирусов НБ и ИЛТ в вакцине определяли с учетом предполагаемого способа ее применения. Опытно-промышленные образцы вакцины испытывали на 15-17-суточных цыплятах породы белый леггорн на базе Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства (г. Санкт-Петербург—Ломоносов).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью методов Кербера в модификации И.П. Ашмарина (7), критерия Стьюдента (t-критерий) и регрессионного анализа с использованием компьютерной программы MaTHCad-2001.

Результаты. Оптимальным для сбора ВСМ оказалось культивирование РЭК в течение 14-15 сут. Во всех опытах применение мембран приводило к повышению ГАА и инфекционной активности вируссодержащего материала. В варианте с фторопластовыми мембранами потери вируса были наибольшими (титр инфекционной активности фильтрата составлял 3,5lg ЭИД50/мл). Максимальное увеличение ГАА (1:8192) отмечали при использовании полых волокон. Применение КФБЖ способствовало повышению пропускной способности мембран в 2-3 раза.

Все испытанные мембраны, обладая 100 % селективностью по белку, частично пропускали его в фильтрат. На ЯМ при кратности концентрирования ВСМ по объему 8,0-16,0 раз аналогичный показатель по белку составлял 1,4-3,5 раза, то есть происходила частичная очистка вируса от сопутствующих белков. Степень очистки вируса на ЯМ оказалась выше, чем на ПВ, — 86,8 по сравнению с 65,2 %.

Наиболее технологичным был признан метод концентрирования ультрафильтрацией на полых волокнах, характеризующийся низкими эксплуатационными расходами и малой энергоемкостью. Его применение позволяло свести к минимуму использование дорогостоящего оборудования, работать с большими объемами вирусного материала, сохранять его биологически активную структуру, легко обеспечить герметичность и асептические условия. Очистка и концентрирование ВСМ проводились практически в одну стадию. Мы установили следующие оптимальные параметры концентрирования вируса на ПВ: рабочее давление — 0,08-0,12 МПа, линейная скорость потока жидкости — 0,1-0,8 м/с.

Рис. 1. Концентрат вируса ньюкаслской болезни, полученный с помощью ультрафильтрации на полых волокнах (увеличение × 62 500).

В процессе концентрирования на полых волокнах была установлена различная селективность в зависимости от срока хранения ВСМ (4 сут — 11-22 %, 25-26 сут — 63-67 %). Кроме того, при концентрировании вирусного материала с малым сроком хранения после сбора получали мутные концентраты, содержащие коагулированные белки. Статистическая обработка экспериментальных данных показала значимое влияние срока хранения ВСМ на стандартность характеристик полученного жидкого концентрата. Таким образом, срок хранения ВСМ перед концентрированием должен быть не менее 10 сут.

Апробация в опытно-промышленных условиях подтвердила воспроизводимость и надежность разработанного метода ультрафильтрации. Полученный биоматериал (ПВ-концентрат) был стерилен и содержал морфологически полноценный вирус. Скопления вирионов характеризовались четко выраженными пепломерами, повреждающего действия процедуры очистки и концентрирования на вирус НБ не наблюдали (рис. 1).

В процессе ультрафильтрации объем ВСМ уменьшался по сравнению с первоначальным в среднем в 10 раз, содержание общего белка снижалось на 65-85 %. Содержание белковых примесей в концентрате было существенно ниже, чем в исходным материале, низкомолекулярные фракции полностью отсутствовали (рис. 2). Величина инфекционной активности концентрата составляла в среднем 9,9lg ЭИД50/мл, гемагглютинирующая активность варьировала от 1:2048 до 1:8192 ГАЕ/мл. Значительное увеличение ГАА вируса (в отдельных случаях до 180 %), возможно, связано с удалением в процессе ультрафильтрации ингибиторов гемагглютининов (8). Косвенным подтверждением наличия ингибитора в фильтрате была его способность снижать титры ГАА в ВСМ. В опытах по выяснению влияния предполагаемого ингибитора ГАА на иммуногенность ЭД50 (эффективная доза для цыплят 15-20-суточного возраста породы белый леггорн, обеспечивающая 50 % защиты) у вакцин из неконцентрированного вируса, вирусного концентрата и вирусного концентрата, смешанного с фильтратом (1:1), составила соответственно 6,2lg ЭИД50/мл, 7,1lg ЭИД50/мл и 6,3lg ЭИД50/мл. 

Как было установлено, очищенный и концентрированный вируссодержащий материал может быть использован для конструирования ассоциированной живой вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц. Выбор второго компонента обусловлен периодически возникающей сложной эпизоотической обстановкой на птицефабриках в разных регионах страны, требующей проведения одновременной вакцинации против НБ и ИЛТ.


Рис. 2. Гель-хроматограммы образцов до и после ультрафильтрации препарата вируса ньюкаслской болезни: 1 — концентрат, 2 — фильтрат, 3 — исходный материал.

Использование концентрата вируса НБ позволяло избежать разбавления вируссодержащего материала ИЛТ, который содержит гомогенизированные хориоаллантоисные оболочки вместе с экстраэмбриональной жидкостью РЭК. Вакцина обеспечивала защиту птицы от 1000 ЛД50 вируса НБ (штамм Т) и вируса ИЛТ (штамм 24а) (соответственно на 100 и 90 %). В настоящее время разработанная нами ассоциированная вакцина против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц внедрена в ветеринарную практику и защищена патентом РФ (9).

Итак, очистка и концентрирование эмбриональной жидкости куриных эмбрионов, содержащей вирус ньюкаслской болезни, методом ультрафильтрации на полых волокнах обеспечивает получение препарата, обладающего высокой биологической активностью, что позволяет использовать его в качестве основного компонента ассоциированных вакцин (живых и инактивированных) против вирусных болезней птицы.


Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К н и з е  А.В.,  Ф и л о м а т о в а  В.А. Анализ структуры мирового ареала ньюкаслской болезни и пространственно-динамический прогноз на территорию России. Ветеринарный консультант, 2007, 14: 6-72.
2. Проведение противоэпизоотических мероприятий. Ежегодный доклад Минсельхоза России (2007 г.) «Состояние и меры по развитию агропромышленного комплекса Российской Федерации». Птицефабрика, 2009, 1-2: 35.
3. Ф и с и н и н  В.И. Стратегические тенденции развития яичного и мясного птицеводства России. Мат. IV Межд. вет. конгресса по птицеводству. М., 2008: 4-22
4. Т и х о н о в  И.В.,  Р у б а н  Е.А.,  Г р я з н е в а  Т.Н. и др. Биотехнология /Под ред. Е.С. Воронина. СПб, 2008.
5. Г р а ч е в а  И.М.,  Г р а ч е в  Ю.П.,  М о с и ч е в  М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М., 1982.
6. К о р о в и н  Р.Н.,  З е л е н с к и й  В.П.,  Г р о ш е в а  Г.А. Лабораторная диагностика птиц. М., 1989.
7. А ш м а р и н  И.П.,  В о р о б ь е в  А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.
8. К р а ш е н ю к  А.И.,  Г о р е ц к а я  Т.И. Концентрирование и очистка вируса ньюкаслской болезни методом микрофильтрации и эксклюзивной жидкостной хроматографии. Acta Virologica, 1988, 32: 353-357.
9. С л о б о д е н ю к  М.И.,  А й р а п е т о в  Р.Г.,  М а л у ш к о  В.В. Способ получения комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц. Патент RU 2 106 52. Приоритет от 16.06.93. Опубл. 10.03.98. Бюл. «Изобретения (заявки и патенты)», 1998, № 7: 162. 

 

METHODS OF MEMBRANE DIVISION OF VIRUS CONTAINING SUSPENSION DURING PRODUCTION OF VACCINE AGAINST BIRD DISEASES

T.A. Skotnikova, E.F. Tokarik, A.Ya. Samuilenko

By the example of infected allantoidal fluid of chicken embryos the authors investigated the efficiency of microfiltration methods (nuclear and fluoroplastic membranes, ultrafiltration on hollow fibers), purification and concentration of Newcastle disease virus (La-Sota strain). The method of concentration by ultrafiltration on hollow fibers ensures the isolation of virus with high biological activity, that permit to its usage as main component of combined vaccines against virus diseases of birds.

Key words: ultrafiltration, membranes, separation, concentration, purification, Newcastle disease virus, associated vaccine.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической
промышленности Россельхозакадемии
,
141142 Московская обл., Щелковский р-н, п/о Кашинцево, 
e-mail: dims82@inbox.ru

Поступила в редакцию
28 мая 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало