БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ

ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ

КАРТА САЙТА

НА ГЛАВНУЮ

Сельскохозяйственная биология, 2009, № 6, с. 60-65.

УДК 636.4:591.11:636.087.72

О РАЗВИТИИ НЕКОМПЕНСИРОВАННОГО РАЗРУШИТЕЛЬНОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ПОРОСЯТ И АНТИОКСИДАНТНОМ ЭФФЕКТЕ СЕЛЕНОПИРАНА

В.И. МАЙСТРОВ², Н.С. ШЕВЕЛЕВ², Т.П. ТРУБИЦИНА¹

С использованием спонтанного и стимулированного вариантов теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) у поросят ландрас х крупная белая и крупная белая х крупная белая в разном возрасте определяли динамику развития свободнорадикальной патологии при стрессе, сопровождающем отъем и перегруппировку. Показано терапевтическое действие селенопирана при некомпенсированном разрушительном окислительном стрессе.

Ключевые слова: поросята, отъем, перегруппировка, стресс, НСТ-тест, селенопиран.

 

После того, как B.N. Park с соавт. (1) показали значение реакции нитросинего тетразолия (НСТ) с активированными полиморфноядерными лейкоцитами (нейтрофилами) для распознавания инфекционного воспаления, она получила широкое распространение в клинической практике (2, 3). В то же время работы по изучению влияния стресса на показатели НСТ-теста немногочисленны, а полученные при этом данные весьма противоречивы: после стрессорных воздействий отмечалось то резкое повышение (4-8), то сильное снижение этих показателей (9, 10), в том числе после стрессорных воздействий без нейтрализации реакции НСТ с макрофагами (11).

Целью нашей работы было проследить за изменениями НСТ-теста как до отъема или перегруппировки, так и после них в суточной или многосуточной динамике.

Методика. Объектом исследований в 1-м опыте служили помесные поросята (ландрас x крупная белая), которых отнимали от трех свиноматок в 60-суточном возрасте полным гнездом до последующей перегруппировки. Перегруппировку проводили в возрасте 70-80 сут (через 10-20 сут после отъема) из трех пометов (по 4-5 особей из каждого). В опытную группу отбирали только свинок (для изучения после полового созревания). Кровь для исследования брали из краниальной полой вены до и через 1, 2 и 8 сут после перегруппировки. Начиная с даты перегруппировки, на основании этологических наблюдений устанавливали ранг каждой особи из опытной группы.

Во 2-м опыте при изучении начального изменения активности полиморфноядерных лейкоцитов у помесных поросят их отнимали гнездом в 60-суточном возрасте. Кровь брали из сосудов хвоста непосредственно при отъеме, а также через 1, 3, 6 и 24 ч после отъема.

В 3-м опыте использовали выравненный по живой массе при рождении и отъеме помет из 12 поросят (крупная белая x крупная белая) от одной свиноматки. Поросята были пронумерованы от переднего правого грудного (№ 1) до заднего левого брюшного (№ 12) соска (правые соски — нечетные, № 1-11, левые — четные, № 2-12), что позволяло до некоторой степени учитывать ранг животных (известно, что поросята высокого ранга занимают, как правило, передние соски, низкого — задние). Поросятам четных (левых) сосков за 2 сут до отъема вводили внутримышечно по 3 мл высокорафинированного подсолнечного масла «Аведовъ» с растворенным селенопираном (10 мг). В контроле (поросята нечетных правых сосков) вводили то же количество масла без селенопирана. Отъем поросят проводили в возрасте 30 сут гнездом без перегруппировки. Кровь брали из краниальной полой вены до отъема, а также через 1, 4, 12 и 21 сут после отъема.

Тест с нитросиним тетразолием (НСТ) в спонтанном варианте в 1-м и 2-м опытах проводили согласно описанию (12). Гепаринизированную кровь инкубировали с НСТ в силиконизированных пробирках, готовили мазки и подсчитывали долю активированных клеток (%) под световым микроскопом («Карл Цейс», Германия; «ЛОМО», Россия) с масляной иммерсией (½900). Поскольку сообщалось, что наиболее активные нейтрофилы даже в силиконизированных пробирках прилипают к поверхности (13), в 3-м опыте тест модифицировали: реакцию с НСТ проводили непосредственно на предметном стекле с окрашиванием 0,1 % нейтральным красным, а не 2,0 % метиленовым зеленым. Кроме того, в 3-м опыте НСТ-тест выполняли как в спонтанном, так и в стимулированном варианте с активированием нейтрофилов опсонизированным зимозаном (13).

Во всех опытах в каждой пробе подсчитывали по 200 нейтрофилов.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием метода Стьюдента (14).

Результаты. В 1-м опыте (табл. 1) через 1 сут после перегруппировки у всех поросят спонтанно активированные нейтрофилы не выявлялись. Поскольку известно, что отъем и перегруппировка сопровождаются стрессом, полученные данные указывали на супрессию нейтрофилов стресс-факторами перегруппировки (9).

1. Доля (%) активированных лейкоцитов в крови помесных поросят (ландрас х крупная белая) в разные сроки после перегруппировки
№ поросенка	До перегруппировки	После перегруппировки
		1-е сут	2-е сут	8-е сут
1	2,5	0	1,0	3,5
2	4,0	0	6,0	4,0
9	1,5	0	0	8,0
10	2,0	0	2,0	7,5
11	5,0	0	6,0	0,5
12	14,0	0	2,0	3,5
13	10,0	0	2,0	0,5
14	3,5	0	1,5	1,5
15	88,5	0	1,0	7,5
16	9,5	0	1,0	1,0
17	6,5	0	0,5	1,5
18	8,0	0	2,0	3,5
19	3,5	0	4,0	2,0
40	3,0	0	4,5	4,5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кроме того, неожиданно высокой (88,5 %) оказалась исходная доля спонтанно активированных нейтрофилов у низшей по рангу свинки № 15, что обычно характерно для бактериальной инфекции (1, 2), подтвердить наличие которой не удалось. Вместе с тем уже через 1 сут наблюдалось полное отсутствие таких нейтрофилов, что было также характерно для других животных группы. В дальнейшем у свинки № 15, несмотря на регулярные пробы хряком на протяжении 24 сут утром и вечером, не выявлялась половая охота, хотя при убое в яичниках было обнаружено девять желтых тел.

При оценке влияния собственно отъема в возрасте 60 сут на показатели спонтанного НСТ-теста (2-й опыт, табл. 2) установили, что уже в первые часы доля НСТ+-нейтрофилов снижалась до 0-1,0 % на фоне очень низкой интенсивности связывания красителя. Столь быстрое развитие супрессирующей реакции свидетельствует о зависимости эффекта стресс-фактора от функции высших отделов головного мозга. Полученные данные (см. табл. 1, 2 и 3) согласуются с выводами о том, что в стадии тревоги нейтрофилы усиленно выбрасывают киллерный запас активных форм кислорода (АФК) наружу, вследствие чего внутри и на поверхности клеток не происходит взаимодействие с НСТ (15, 16). Необходимое условие этого — наличие на поверхности нейтрофилов специфического рецептора к указанному стресс-агенту. Как только его концентрация в крови оказывается выше порогового значения, все нейтрофилы выбрасывают запас АФК наружу, и доля активированных нейтрофилов в реакции с НСТ обычно становится равной 0 %, в отдельных случаях не превышая 0,50-1,00 % (см. табл. 2).

2. Доля (%) активированных лейкоцитов в крови помесных поросят (ландрас х крупная белая) в первые часы после отъема
№ поросенка	При отъеме	После отъема
		1-й ч	3-й ч	6-й ч	24-й ч
1	2,25	0	0	0	0
2	3,00	0	0	0	0
3	5,50	0	0	0	0
4	6,00	1,00	0	0	0
5	10,00	1,00	1,00	0,50	0
6	7,00	0	1,00	0,50	0
7	1,50	0	0,50	0	0,50

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В 3-м опыте в спонтанном варианте НСТ-теста (см. табл. 3) у поросят в обеих группах (опыт и контроль) в крови не выявлялись активированные нейтрофилы (0 %) (за исключением поросенка № 10, у которого показатель составил 0,5 % (один НСТ+-нейтрофил на 200 подсчитанных). Однако уже на 4-е сут долю НСТ+-нейтрофилов, равную 0 %, регистрировали только у поросят № 7 и № 12 (соответственно контроль и опыт). Следует отметить, что полученные данные свидетельствуют о стресс-зависимости этих животных. Стресс-независимых особей, у которых через 1 сут после отъема и перегруппировки содержание НСТ+-нейтрофилов соответствует норме, мы не обнаружили.

На 4-е сут после отъема у большинства поросят (№№ 1, 3, 5 в контроле и №№ 2, 4, 6, 8, 10 в опытной группе) содержание НСТ+-нейтрофилов нормализовалось. Однако у животных № 9 и № 11 наблюдалось значительное увеличение доли НСТ+-нейтрофилов — соответственно до 31,5 и 38,0 %, что характерно, как уже отмечалось, для бактериальной инфекции (1, 2). В нашем опыте у поросят не наблюдалось признаков инфекционного заболевания (повышение ректальной температуры, сыпь на коже и т.д.), то есть возможна иная причина роста изучаемого показателя.

Очевидно, что отсутствие НСТ+-нейтрофилов указывает на выброс в кровь киллерного потенциала АФК. У большинства поросят до 4-х сут после отъема такой выброс компенсировался соответствующими механизмами антиоксидантной системы, нормализующими число НСТ+-нейтрофилов. В то же время у поросят № 9 и № 11 компенсация выброса АФК по какой-то причине не произошла либо произошла частично. Оставшиеся свободные АФК дали начало цепным реакциям переокисления липидов, что, в свою очередь, привело к разрушению мембран клеток эндотелия сосудов миокарда, скелетных мышц и, возможно, других тканей. Далее содержимое этих клеток полностью или частично поступило в кровь и (подобно тому, что происходит при воспалениях) было опознано нейтрофилами как чужеродный объект. В результате большая доля нейтрофилов оказалась в активированном состоянии, которое продолжалось не менее 12 сут после отъема поросят.

Поросята № 7 и № 12, очевидно, могут быть охарактеризованы как более стресс-зависимые, чем животные № 9 и № 11, поскольку у первых НСТ+-нейтрофилы выявлялись не ранее 4-х сут после отъема, то есть выброс АФК из клеток происходил в течение более продолжительного времени. Поэтому период повышенной активности нейтрофилов у поросят № 7 и № 12 продлился, по-видимому, дольше — возможно, еще и потому, что активированные нейтрофилы постоянно выбрасывают наружу некоторое количество АФК (17). Этим поддерживается неравновесие в оксидантно-антиоксидантной системе у поросят-отъемышей в пользу оксидантов (АФК). У остальных животных (№№ 1, 3, 5 в контрольной группе и №№ 2, 4, 6, 8, 10 — в опытной) стресс, вызванный ранним отъемом, вероятно, не привел к тяжелым последствиям, поскольку доля НСТ+-нейтрофилов во все сроки отбора проб крови не превышала норму. По нашим данным, нормой следует считать 1,5-16,5 % (без усреднения показателей, часто искажающего оценку реально происходящих процессов).

Отметим также, что поросята с повышенной долей НСТ+-нейтрофилов занимали задние соски, то есть имели более низкий ранг. Возвращаясь к данным по свинке № 15 (см. табл. 1) с содержанием НСТ+-нейтрофилов 88,5 % перед перегруппировкой, следует считать, что к 9-м сут после отъема (перед перегруппировкой) у нее сформировался ответ нейтрофилов на стресс на фоне статуса низшей по рангу в группе. То есть свинка № 15 тяжело перенесла отъем в 60-суточном возрасте, что сопровождалось развитием некомпенсированного разрушительно-окислительного стресса (НРОС) высокой напряженности. То же относится к поросятам №№ 7, 9, 11 и 12 (см. табл. 3), которые тяжело перенесли стресс раннего отъема (в возрасте 30 сут) с той разницей, что напряженность стресса у них, вероятно, была меньше.

Обращает на себя внимание факт, что в опытной группе на фоне применения селенопирана только один поросенок тяжело перенес стресс раннего отъема, тогда как в контроле таких животных было в 3 раза больше. По-видимому, селенопиран оказал мощную поддержку антиоксидантной системе. В этом отношении селенопиран выступает типичным «мусорщиком» (англ. scavenger), устраняющим цепные реакции переокисления липидов, инициированные АФК.

Как и следовало ожидать, у всех поросят доля активированных нейтрофилов в стимулированном варианте НСТ-теста (табл. 4) была значительно больше, чем в спонтанном (для сравнения см. табл. 3), и, кроме того, у всех животных оказалась намного выше до отъема, чем спустя 24 ч. Представляет также интерес анализ причин, по которым этот показатель через 24 ч не равен 0 % (что наблюдается в спонтанном варианте НСТ-теста).

Мы предположили существование на поверхности нейтрофила рецепторов к агенту, действующему на отделы головного мозга при психоэмоциональном стрессе, вследствие чего активированные нейтрофилы выбрасывают в кровь запасы АФК, однако это не отмечается в стимулированном варианте НСТ-теста (в противном случае все активированные нейтрофилы в пробе крови через 24 ч после отъема должны были высвободить АФК еще до постановки реакции с НСТ). Иными словами, всегда имеется некая популяция нейтрофилов (см. табл. 3 и 4), которая может быть дополнительно простимулирована опсонизированным зимозаном по типу дыхательного взрыва. Такие нейтрофилы будут выбрасывать супероксидный анион кислорода, который, в свою очередь, начнет реагировать с НСТ, формируя кристаллы зимозана на поверхности и внутри клеток.

В стимулированном варианте НСТ-теста, в котором результат оценивается по принципу «больше—меньше» (в отличие от спонтанного, где реализуется принцип «все или ничего»), не может быть получена информация о НРОС для каждого животного индивидуально и требуется наличие группы особей с усреднением для оценки статистической достоверности различий. В то же время в наших исследованиях средние показателям в стимулированном варианте НСТ-теста в контроле и опыте (инъекция селенопирана) не различались во все сроки, в то время как в спонтанном диагноз НРОС был поставлен трем животным, не получавшим селенопирана, и одному получавшему. Некоторое достоверное снижение среднего показателя наблюдали только на 1-е сут.

Обычно результаты, полученные в стимулированном варианте НСТ-теста, трактуют как показатель степени максимально возможной в текущих условиях активации нейтрофилов. Подчеркнем, что спонтанный вариант НСТ-теста, позволивший с использованием относительно простого приема установить факт НРОС индивидуально для животного (18), в наших опытах оказался намного более информативным стимулированного и пригодным для клинических анализов. Нам также удалось показать, что при стрессе в спонтанном НСТ-тесте может отмечаться как резкое снижение, так и резкое повышение доли НСТ+-нейтрофилов, что зависит от срока отбора крови для анализа и состояния оксидантно-антиоксидантной системы.

Итак, у всех поросят в период отъема и перегруппировки возникает окислительный стресс (у некоторых животных он носит характер некомпенсированного разрушительного окислительного стресса — НРОС). В период раннего отъема (30 сут) половина животных гнезда, имеющих более низкий ранг, оказалась в состоянии НРОС. В то же время у аналогов того же помета, получавших селенопиран в пролонгированной форме (10 мг/гол.), НРОС развился только у одного животного (причем самого низкого ранга) из шести. Это свидетельствует о мощном действии селенопирана как антиоксиданта, что, однако, обнаруживается только в спонтанном варианте реакции нейтрофилов с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Необходимо подчеркнуть, что все животные, у которых отмечалось высокое содержание активированных нейтрофилов, указывающее на развитие НРОС, имели низкий и низший ранги.

Авторы выражают благодарность профессору В.А. Галочкину (Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, г. Боровск, Калужская обл.) за предоставленный препарат селенопирана, а также указание на его возможную дозировку и способ введения.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. P a r k  B.N.,  F i k r i g  S.M.,  S m i t h w i c k  E.M. Infection and nitroblue-tetrazolium reduction by neutrophils. Lancet, 1968, 2: 532-534.
2. М а я н с к и й  А.Н.,  Г а л и у л л и н  А.Н. Реактивность нейтрофила. Казань, 1984.
3. М а я н с к и й  А.Н.,  М а я н с к и й  Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. 2-е изд. Новосибирск, 1989.
4. G r e i g  H.B. The nitroblue tetrazolium test in Black patients. S. Afr. Med. J., 1975, v. 13, ¹ 49(39): 1595-1597.
5. K ö l m e l  H.V.,  E g r i  T. The significance of nitroblue tetrasoleum test in cerebrospinal fluids in bacterial and abacterial meningitis. Infection, 1980, 8(4): 142-146.
6. F l e t c h e r  M.P.,  V a s s a r  M.J.,  H o l c r o f t  J.W. Patients with adult respiratory distress syndrome (ARDS) demonstrate in vivo neutrophil activation associated with diminished binding of neutrophil-specific monoclonal antibody 31D8. Inflammation, 1988, 12(5): 455-473.
7. Z h a n g  X.L. Hypoferremia following surgery: a defense mechanism after operative trauma. (на китайском яз., цит. по PubMed.com; abstracts). Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 1990, 28(2): 113-128.
8. M i a n  R.,  S h e l t o n - R a v n e r  G.,  H a r k i n  B. e.a. Observing a fetitious stressful event: haemotological changes, including circulating leukocyte activation. Stress, 2003, 6(1): 41-47.
9. Б у р к о в  И.А.,  М а й с т р о в  В.И.,  Т р у б и ц и н а  Т.П. Активность нейтрофилов поросят по НСТ-тесту в период отъема и перегруппировки. Бюлл. ВНИИФБиП с.-х. животных, 1988, 4(92): 55-57.
10. C i o c o i u  M.,  B a d e s k u  M.M.,  L u p u s o r u  E.C. The intervention of antioxidant therapy on platelet adhesion and immunomodulation in experimental physical stress. Free Radic. Res., 2007, 41(7): 829-838.
11. Б у л а т о в а  Н.Р.,  Р о м а н о в а  Е.А.,  К р и н с к а я  А.В. и др. Постстрессорная корреляция функциональной активности макрофагов тафтсином и его производными. Бюлл. эксп. биол. мед., 1989, 108(7): 64-67.
12. Ш у б и ч  М.Г.,  М е д н и к о в а  В.Г. NBT-тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях. Лаб. дело, 1978, 9: 515-518.
13. Б ы к о в а  А.А.,  С е д и н и н а  Н.С. Состояние фагоцитарной системы крови в НСТ-тесте в отдаленном периоде у участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС. Клин. лаб. диагн., 2003, 7: 16-18.
14. О в с я н н и к о в  А.И. Основы опытного дела в животноводстве. М., 1976.
15. K a n g  D.H.,  M c C a r t h y  D.O. The effect of psychological stress on neutrophil superoxide release. Res. Nurs. Health, 1994, 17(5): 363-370.
16. K r i s t a l  B.,  S h e r t z - S w i r s k i  R.,  C h e z a r  J. e.a. Participation at peripheral polymorphonuclear leukocytes in the oxidative stress and inflammation in patients with essential hypertension. Am. J. Hypertens., 1998, 11(8): 921-928.
17. H o f f m a n  J.W. Jr.,  G i l b e r t  T.B.,  P o s t o n  R.S. e.a. Myocardial reperfusion injury: etiology mechanism and therapies. J. Extra Corpor. Technol., 2004, 36(4): 391-411.
18. М а й с т р о в  В.И.,  Т р у б и ц и н а  Т.П.,  Г р у ш к и н  А.Г. и др. Регистрация повреждающего окислительного стресса в организме высших животных или человека. Российское Авторское Общество, 2007, ¹ 12884 от 30 ноября 2007 г.

 

ABOUT DEVELOPMENT OF NONCOMPENSATED DESTRUCTIVE STRESS IN PIGLETS AND ANTIOXIDANT EFFECT OF SELENOPYRAN

V.I. Maistrov², N.S. Shevelev², T.P. Trubitsina¹

With usage of spontaneous and stimulated variants of nitro blue tetrazolium test in piglets of Landrace х Large White and Large White х Large White in various age the authors determined a dynamics of development of free radical pathology connected with stress after the weaning and the regrouping. The therapeutic action of selenopyran was shown on the noncompensated destructive oxidative stress.

Key words: piglets, weaning, regrouping, stress, NBT-test, selenopyrane.

1ГНУ Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии, 249013 Калужская обл., г. Боровск, пос. Институт; 2ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, e-mail: vimaistrov@ya.ru

Поступила в редакцию 21 мая 2009 года

 

Оформление электронного оттиска