УДК 615.324:579.873.21

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФОРМ ХИТОЗАНА НА ШТАММЫ Mycobacterium

Е.В. КРЫЖАНОВСКАЯ, В.П. ВАРЛАМОВ, А.Я. САМУЙЛЕНКО, А.И. АЛБУЛОВ, С.М. ШИНКАРЕВ, М.А. ФРОЛОВА, Н.К. ЕРЕМЕЦ, Н.А. БОНДАРЕВА, В.Б. ХАБАРОВ, А.В. ГРИНЬ

Изучали снижение численности атипичного и патогенных штаммов Mycobacterium в зависимости от времени воздействия, а также молекулярной массы и степени деацетилирования форм хитозана.

Ключевые слова: хитозан, антибактериальные свойства, молекулярная масса, степень деацетилирования, тест-культура.

 

Известно, что хитозан обладает антибактериальными свойствами в отношении многих микроорганизмов — бактерий, вирусов, грибов (в том числе патогенных), а также некоторых штаммов дрожжей (1, 2), что в сочетании с высокой сорбционной емкостью и низкой токсичностью полимера для организма животных и человека служит основанием для его использования при разработке лечебно-профилактических и дезинфицирующих препаратов. Противомикробный эффект олигомеров хитозана связан со способностью влиять на механизм репродукции. Кроме собственно антибактериального действия, хитозан повышает чувствительность к антибиотикам некоторых устойчивых к ним микроорганизмов (3, 4). Показано, что наибольшей антимикробной активностью по отношению ко многим бактериям обладает низкомолекулярный хитозан, причем хитозаны с высокой степенью деацетилирования (СД) наиболее эффективны (5).

Поскольку среди зооантропонозных заболеваний туберкулез по социальному и экономическому значению занимает особое место, нанося значительный ущерб сельскому хозяйству из-за высокой чувствительности к нему животных, особенно крупного рогатого скота, свиней и кур, поиск новых направлений антимикробной терапии туберкулеза на сегодняшний день представляет собой актуальную задачу.

В связи с этим целью нашей работы было изучение антибактериальной активности хитозанов с различной молекулярной массой по отношению к микроорганизмам рода Mycobacterium.

 Методика. В работе использовали крабовые хитозаны (Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г. Щелково) и хитозаны, полученные из восковой моли (Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва) с молекулярной массой (ММ) 4,0; 7,0; 8,5; 11,0; 24,0; 96,0; 177,0 и 396,0 кДа. Тест-культурами служили атипичный штамм Mycobacterium stegmatis, а также штаммы M. avium и M. bovis. Действие хитозана выявляли, культивируя микроорганизмы в мясопептонном бульоне  (рН 7,4; 37 °С, на качалке при 100 об/мин) с добавлением хитозана в концентрации 0,1 %, контроль — среда без хитозана (время воздействия в разных опытах — от 10 мин), после чего определяли титр жизнеспособных клеток в отобранных пробах при высеве на агаризованную среду (1 % мясопептонный агар, рН 7,4, 37 °С) и рассчитывали долю гибели (снижение численности относительно контроля, %).

Для оценки зависимости антибактериального эффекта кислоторастворимого хитозана от ММ и времени воздействия использовали методы регрессивного и корреляционного анализа (применяли стандартные пакеты программы Microsoft Excel).

Результаты. Доля погибших клеток M. stegmatis при воздействии в течение 60 мин варьировала от 0 до 76 % в зависимости от ММ хитозана (рис. 1). Наименьшей была чувствительность штамма к высокомолекулярным формам (ММ 96 и 177 кДа): снижение числа клеток микобактерий соответственно 29 и 13 %. Высокомолекулярный образец (396,0 кДа) в концентрации 0,1 % не проявлял антибактериального действия, а максимальной активностью обладали низкомолекулярные хитозаны (4,0-11,0 кДа; доля погибших клеток 76 %). У отрицательно заряженных форм — N-сукцинилхитозана, сульфата хитозана, карбоксиметилхитозана антибактериальную активность не выявили.

 

Рис. 1. Снижение численности Mycobacterium smegmatis при действии крабового хитозана (А) и хитозана, полученного из восковой моли, (Б) в зависимости от молекулярной массы. Длительность воздействия — 60 мин, концентрация хитозана в среде — 0,1 %.

Анализируя влияние времени воздействия препаратов хитозана (10, 30, 60 и 120 мин) на численность микобактерий, мы показали, что уже при 10 мин 38-60 % клеток утрачивали жизнеспособность (рис. 2), причем в варианте с низкомолекулярным хитозаном отмечалась более высокая чувствительность микобактерий.

 

Рис. 2. Снижение численности Mycobacterium stegmatis при разной длительности воздействия хитозаном: 1, 2 и 3 — соответственно молекулярная масса 4,0; 11,0 и 24,0 кДа (1 и 3 — крабовый хитозан, 2 — хитозан, полученный из восковой моли).

Учитывая разницу строения клеточной стенки и генома атипичных и патогенных микобактерий, изучили вли-яние ряда низкомолекулярных образцов хитозана на патогенные штаммы M. avium и M. bovis. Хитозаны с ММ 58,0 и 87,0 кДа (соответственно СД 80 и 84 %) в концентрации 0,1 % подавляли рост M. avium полностью, M. bovis — соответственно у  40 и 50 % клеток. К хитозану с ММ 38,0 кДа (0,1 %) бактерии M. avium оказались менее чувствительными (гибель клеток 25 %), рост бактерий M. bovis практически не угнетался.

Снижение антибактериальной активности хитозана с ММ 38,0 кДа можно объяснить невысокой степенью деацетилирования (СД) (78 %). С ростом СД число NH2-групп увеличивается, следовательно, повышается величина положительного заряда молекулы. При проверке антибактериального действия полимера с отрицательным зарядом на патогенные штаммы M. avium и M. bovis обработали N-сукцинилхитозаном с ММ 380,0 кДа и не выявили антимикробного эффекта. Следовательно, при введении отрицательно заряженных групп в молекулу хитозана фактически происходит утрата его антибактериальных свойств.

Таким образом, показано, что низкомолекулярный кислоторастворимый хитозан проявляет антибактериальную активность по отношению к штаммам Mycobacteriumstegmatis и, как минимум, бактериостатическое действие на возбудителей туберкулеза. То есть препараты на его основе могут быть использованы для профилактики этого заболевания в птицеводческих и животноводческих хозяйствах.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. G i l  G.,  d e l  M o n a k o  S.,  C e r r u t t i  P. e.a. Selective antimicrobial activity of chitozan on beer spoilage bacteria and brewing yeasts. Biotec. Let., 2004, 26: 569-574.
2. S m i t h  J.,  W o o d  E.,  D o r n i s h  M. Effect of chitosan on epithelial cell light junctions. Pharmac. Res., 2004, 21(l): 43-49.
3. Г а м з а з а д е  А.И.,  Н а с и б о в  СМ.,  Л у к и н  О.В. Антибактериальная активность хитозанов. Мат. 8-й Междунар. конф. «Современные перспективы и исследования хитина и хитозана». Казань, 2006: 183-186.
4. U c h i d a  Y. Antibacterial activity by chitin and chitosan. Food Chemical, 1998, 2: 22-29.
5. Ч е р в и н е ц  В.М.,  Б о н д а р е н к о  В.М.,  С м о л е н с к а я Л.П. и др. Ацилакт и пищевой хитозан в лечении язвенной болезни. Мат. 8-го Всерос. съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002: 273-274.

 

ANTIBACTERIAL ACTION OF THE CHITOSAN FORMS ON Mycobacterium STRAINS

E.V. Kryzhanovskaya, V.P. Varlamov, A.Ya. Samuilenko, A.I. Albulov, S.M. Shinkarev, M.A. Frolova, N.K. Yeremets, N.A. Bondareva, V.B. Khabarov, A.V. Grin’

The authors studied the decrease in the number of atypical and pathogenic strains of Mycobacterium in connection with exposure time and also molecular mass and deacetylation of chitosan forms.

Key words: chitosan, antibacterial property, molecular weight, deacetilate degree, test-culture.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский
и технологический институт биологической
промышленности Россельхозакадемии
,
141142 Московская обл., Щелковский р-н, пос. Биокомбината,
e-mail: vnitibp@mail.ru;
Центр «Биоинженерия» РАН,
117984 г. Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1;
Институт физической химии и электрохимии
им. А.Н. Фрумкина
,
119991 г. Москва, Ленинский просп., 31, корп. 4,
e-mail: isiv@phyche.ac.ru

Поступила в редакцию
10 сентября 2008 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало