УДК 636.52/.58:575.113
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ТОЛЩИНУ СКОРЛУПЫ ЯЙЦА У ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ
Ю.А. ХИМАНИНА, А.Л. САЗАНОВА, В.А. СТЕКОЛЬНИКОВА, Т. МАЛЕВСКИ, К. ЯЩАК, А.А. САЗАНОВ
У двух пород домашней курицы разных направлений использования (яичная род-айленд и неспециализированная польская зеленоногая) методом полимеразной цепной реак-ции в реальном времени провели анализ экспрессии 12 генов-кандидатов контроля хозяйственно значимого признака — толщины скорлупы яйца. У птицы породы польская зеленоно-гая выявлены достоверные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии последовательности CR523443.
Ключевые слова: экспрессия генов, ПЦР в реальном времени, гены-кандидаты, толщина скорлупы яйца, домашняя курица.
Большинство хозяйственно ценных признаков домашних животных имеет сложный полигенный тип наследования и контролируется многими генами, расположенными в локусах количественных признаков (quantitative trait loci ? QTL). Изучение комплексной молекулярной архитектуры QTL представляет интерес с точки зрения общей генетики, а данные о нуклеотидных последовательностях из районов QTL могут быть использованы для селекции на основе полиморфных вариантов генов, определяющих проявление важных в практическом отношении свойств. У домашней курицы одним из таких признаков служит толщина скорлупы яйца, поскольку ее оптимизация позволяет уменьшить потери птицеводческой продукции при транспортировке.
Полногеномное сканирование сцепления микросателлитных локусов и признаков качества яйца у домашней курицы, проведенное на породах польская зеленоногая и род-айленд (соответственно GLP и RIR), выявило значительное влияние генотипа (чистопородные особи GLP и RIR и гибриды F1 GLP х RIR) по 16 признакам: возраст половой зрелости, общая индивидуальная яйценоскость, масса тела на 20- и 33-ю, потребление корма на 33-ю, масса яйца на 53-ю, удельная масса яйца на 33-ю, плотность яичного белка на 53-ю, масса желтка на 33-ю, белка — на 33- и 53-ю, скорлупы — на 33- и 53-ю, окраска скорлупы на 33-ю, толщина скорлупы на 33- и 53-ю нед жизни (1, 2).
О генах, вовлеченных в процесс формирования скорлупы яйца, известно относительно мало. В экспериментах по позиционному клонированию района хромосомы 4 домашней курицы, содержащему QTL толщины скорлупы на 53-ю нед жизни (ST53), найдены маркеры интервала генетической карты, контролирующего QTL ST53, установлены координаты 20 клонов, имеющих гомологию последовательностей ДНК-вставки с микросателлитными локусами MCW0170, LEI0081, MCW0114 и ADL0241, а также их локализация на хромосоме. Для признака ST53 выявлен критический интервал величиной 1,2 млн п.н. и идентифицировано 20 позиционных генов-кандидатов (3).
Следует отметить, что позиционный подход был успешно применен для генетической диссекции и скрининга генов-кандидатов количественных признаков у других видов животных (4). Так, у крупного рогатого скота ген диацилглицерол-О-ацилтрансферазы 1 (DGAT1) определен в качестве гена-кандидата, детерминирующего содержание жира в молоке (5-7).
В настоящей работе мы провели анализ экспрессии генов-кандидатов, участвующих в контроле толщины скорлупы яйца у домашней курицы.
Методика. Объектами исследования служила птица пород род-айленд (яичное направление использования) и польская зеленоногая (неспециализированная).
Материал для анализа отбирали у кур RIR и GLP (по 5 особей каждой породы), несущих яйца с разной толщиной скорлупы (признак ST53, высокие и низкие значения показателя — соответственно STH и STL). Толщину скорлупы трех последовательных яиц на 53-ю нед жизни несушки измеряли микрометром, через 5 сут яйцеводы изолировали и использовали для выделения мРНК. Нижнюю часть яйцевода (uterus) выявляли по наличию яйца с формирующейся скорлупой и отделяли. От каждой особи брали по 50-100 мг ткани, из которой выделяли мРНК при помощи TRIZol реагента («Sigma-Aldrich», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
1. Характеристика праймеров и условий полимеразной цепной реакции при анализе генов-кандидатов, участвующих в контроле толщины скорлупы яйца у кур пород род-айленд и польская зеленоногая |
|||
Идентифи- |
Нуклеотидная последовательность |
Температура |
Длина фрагмента, п.н. |
XM_420335 |
fw 5′-gacagcagccatgcaaagta-3′ |
60 |
143 |
U10548 |
fw 5′-Gtgaacgttacgctgctcaa-3′ |
60 |
119 |
CR390814 |
fw 5′-Aacaataggcctgaccgttg-3′ |
60 |
120 |
CR523443 |
fw 5′-Catctctggctgggttcttc-3′ |
59 |
115 |
XM_420348 |
fw 5′-gagctgccaaaaactgcttc-3′ |
59 |
142 |
NM_001031126 |
fw 5′-gcagcagaaagagcagagg-3′ |
59 |
103 |
XM_420350 |
fw 5′-Aacgacctggagaagcagaa-3′ |
59 |
149 |
XM_420351 |
fw 5′-gctgctgtgcgtcgtg-3′ |
59 |
135 |
XM_420352 |
fw 5′-Cttctgtggagctgggagtc-3′ |
60 |
101 |
XM_420353 |
fw 5′-Agatgcagttccctgaaagc-3′ |
59 |
142 |
XM_420354 |
fw 5′-tgctgtccaaacaaaatgga-3′
rv 5′-Cagtttgggtcaatgccttt-3′ |
60 |
143 |
NM_205361 |
fw 5′-cgatcacagtggtggttgtc-3′ |
60 |
105 |
NM_205295 |
fw 5′-Tgggtgtaatgagcacctga-3′ |
60 |
111 |
XM_420355 |
fw 5′-Ccgtcttcccttcacctgta-3′ |
60 |
115 |
XM_420356 |
fw 5′-Tcacatgttgaatggtgcaa-3′ rv 5′-agtgcccgatagtctctgga-3′ |
59 |
101 |
XM_420357 |
fw 5′-Ctcagccgactctttccag-3′ |
58 |
106 |
XM_420358 |
fw 5′-Actttgggcaccagcattac-3′ |
60 |
129 |
XM_420359 |
fw 5′-gaggatgagtcgtggagagc-3′ rv 5′-agctgcgataactcctctgc-3′ |
59 |
111 |
XM_420360 |
fw 5′-Gttgtttgcgttccattgtg-3′ rv 5′-tgttcagcaatcacgtccat-3′ |
59 |
110 |
XM_420361 |
fw 5′-Ggagaacagcacggtgactt-3′ |
60 |
142 |
П р и м е ч а н и е. fw и rv — соответственно прямой и обратный праймер. |
|||
Дизайн олигонуклеотидов-праймеров для полимеразной цепной реакции в реальном времени (real-time PCR) (PТ-ПЦР) осуществляли на основании баз данных (www.nlm.ncbi.nih.gov и www.ensembl.org) при помощи компьютерной программы PRIMER_INPUT_3 (www.genome.wi.mit.edu) (табл. 1). У полученных последовательностей праймеров оценивали специфичность и отсутствие возможной внутригеномной гомологии, используя пакет программ «Электронный ПЦР» и BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) с варьирующими параметрами величины окна, допустимой доли (%) идентичности пар оснований, фильтрации повторов.
Синтез однонитевой кДНК проводили при помощи набора Enhanced Avian Reverse Transcriptase PCR Kit («Sigma-Aldrich», США). Смесь для амплификации содержала: 2 мкл продукта обратной транскрипции, 10 мкл реагента SYBR Green JumpStart Taq Ready Mix Capillary Formulation («Sigma-Aldrich», США) и по 2 мкл 5 мM раствора каждого праймера; конечный объем — 20 мкл. ПЦР проводили в термоциклере LightCycler («Roche», Швейцария) в следующем режиме: начальная денатурация (5 мин при 95 °С), 40 циклов амплификации (10 с при 95 °С, 10 с при 55 °С, 15 с при 72 °С). Кривую плавления анализировали в интервале 65-95 °С для проверки специфичности амплификации. Ген глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) домашней курицы (идентификационный номер NM_204305; последовательности праймеров: GAPDHfw — 5?-CCTCTCTGGCAAAGTCCAAG-3?; GAPDHrv — 5?-CATCTGCCCATTTGATGTTG-3?) использовали в качестве реферативного. Относительные количества амплифицируемых последовательностей вычисляли методом 2??Ct. Расчеты проводили при помощи программы Excel 2003 («Microsoft», США).
Результаты. Средние значения и стандартные отклонения по показателю ST53 у птицы в группах RIR STH, RIR STL, GLP STH и GLP STL составили соответственно 378,40±3,65; 227,80±8,99; 372,40±2,07 и 248,60±16,62 мкм.
2. Результаты анализа экспрессии генов-кандидатов, участвующих в контроле толщины скорлупы яйца у кур пород род-айленд и польская зеленоногая |
|||||
Идентификационный номер |
Описание гена/последовательности |
Род-айленд |
Польская зеленоногая |
||
O |
r |
O |
r |
||
U10548 |
Ген ассоциированного с лизосомами |
1,12 |
-0,04 |
0,80 |
0,26 |
CR390814 |
Анонимный кДНК-клон ChST974b18 |
1,31 |
-0,14 |
0,75 |
0,26 |
CR523443 |
Анонимный кДНК-клон ChST985k21 |
1,34 |
-0,25 |
0,49* |
0,85* |
NM_001031126 |
Ген митоген-активируемой протеинкиназы 4 (MAP4K4) |
0,49 |
-0,18 |
0,85 |
0,28 |
XM_420350 |
Наличие гомологии гену предсказанного белка FLJ10178 |
1,10 |
-0,47 |
1,20 |
0,31 |
XM_420354 |
Наличие гомологии гену предсказанного белка 2610030H06Rik |
0,74 |
0,38 |
0,70 |
0,41 |
NM_205361 |
Ген мелатонинового рецептора Mel-1c (MTMR1C) |
1,10 |
-0,13 |
1,42 |
-0,07 |
NM_205295 |
Ген белка 2А группы высокой мобильности (HMG2a) |
1,35 |
-0,40 |
1,39 |
-0,11 |
XM_420356 |
Наличие гомологии гену миотутуляринподобного белка 1 (MTMR1) |
0,76 |
0,14 |
0,96 |
0,35 |
XM_420357 |
Наличие гомологии гену миотутулярина (MTM1) |
0,70 |
0,17 |
0,99 |
0,06 |
XM_420359 |
Наличие гомологии гену предсказанного белка LOC91966 |
1,34 |
0,36 |
1,24 |
-0,05 |
XM_420360 |
Наличие гомологии гену белка А семейства со сходными последовательностями 11 (FAM11A) |
1,30 |
-0,26 |
0,72 |
0,28 |
П р и м е ч а н и е. О — отношение средних значений уровня экспрессии приведенной последовательности между вариантами с толстой и тонкой скорлупой. |
|||||
Пробная амплификация на матрице кДНК из тканей яйцевода позволила установить экспрессию 12 из 20 возможных генов-кандидатов в пределах разрешающей способности РТ-ПЦР (до 40 циклов при количестве матрицы 100 нг). У птицы породы род-айленд анализ экспрессии 12 генов-кандидатов не выявил статистически достоверных различий между особями из групп с толстой и тонкой яичной скорлупой, а также заметной корреляции между уровнем экспрессии и проявлением признака ST53 (табл. 2), что, по всей видимости, объясняется снижением гетерозиготности в результате стабилизирующего отбора по качеству скорлупы, которому подвергалась эта порода яичного направления. У птицы неспециализированной породы польская зеленоногая обнаружили достоверные (P < 0,01) 2-кратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии последовательности CR523443 (см. табл. 2), который был связан с толщиной скорлупы (коэффициент корреляции r = 0,85).
Последовательность CR523443 длиной 2102 п.н., представляющая собой клон полностью секвенированной кДНК ChEST985k21 домашней курицы, впервые была найдена в мРНК, экстрагированной из мышц взрослой птицы, а затем обнаружена в гениталиях самок, мозге и хрящевой ткани (www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene). Анализ CR523443 с помощью компьютерной программы BLAST не выявил гомологичных последовательностей у других позвоночных животных.
Таким образом, мы установили, что последовательность CR523443 может рассматриваться как ген-кандидат, участвующий в контроле толщины скорлупы яйца у домашней курицы. Это дает инструмент для поиска однонуклеотидных полиморфизмов, влияющих на количественные признаки (QTN), которые можно использовать как молекулярные маркеры в селекции сельскохозяйственных животных.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. W a r d e c k a B., O l s z e w s k i R., J a s z c z a k K. e.a. Preliminary mapping of QTLs affecting egg quality on chromosomes 1-5 in chickens. Czech J. Animal Sci., 2003, 48: 97-105.
2. W a r d e c k a B., O l s z e w s k i R., J a s z c z a k K. e.a. Relationship between microsatellite marker alleles on chromosomes 1-5 originating from the Rhode Island Red and Green-legged Partrigenous breeds and egg production and quality traits in F(2) mapping population. J. Appl. Genet., 2002, 43: 319-329.
3. S a z a n o v A.A., R o m a n o v M.N., W a r d e c k a B. e.a. Chromosomal localization of fifteen large insert BAC clones containing three microsatellites on chicken chromosome 4 (GGA4) which refine its centromere position. Animal Genet., 2005, 36: 161-163.
4. G l a z i e r A.M., N a d e a u J.H., A i t m a n T.J. Finding genes that underlie complex traits. Science, 2002, 298: 2345-2349.
5. G r i s a r t B., C o p p i e t e r s W., F a r n i r F. e.a. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: Identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition. Genome Res., 2002, 12: 222-231.
6. G r i s a r t B., F a r n i r F., K a r I m L. e.a. Genetic and functional confirmation of the causality of the DGAT1 K232A quantitative trait nucleotide in affecting milk yield and composition. PNAS USA, 2004, 101: 2398-2403.
7. F u r b a s s R., W i n t e r A., F r i e s R. e.a. Alleles of the bovine DGAT1 variable number of tandem repeat associated with a milk fat QTL at chromosome 14 can stimulate gene expression. Physiol. Genomics, 2006, 25: 116-120.
ANALYSIS OF EXPRESSION OF THE GENES-CANDIDATES DETERMINING THE SHELL THICKNESS IN HEN EGGS
Yu.A. Khimanina, A.L. Sazanova, V.A. Stekol’nikova, T. Malevski, K. Yashchak, A.A. Sazanov
By the method of polymerase chain reaction in real time the authors analyzed the expression of 12 genes-candidates determining the shell thickness in 2 breeds of domestic hen (Rhode Island and Polish Green-legged). In birds of the Polish breed the authors revealed the reliable distinction between groups with thin and thick shell in level of expression of CR523443 sequence.
Key words: gene expression, real-time PCR, candidate genes, shell thickness, chicken.
ГНУ Всероссийский НИИ генетики и разведения |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
