doi: 10.15389/agrobiology.2025.5.827rus
УДК 633.15:581.163
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант №24-13-00063). Экспериментальный материал создан при выполнении темы Минобрнауки России FNWF-2022-0006.
ВОЗНИКНОВЕНИЕ ДИПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ В ДИПЛОИДНО-ТЕТРАПЛОИДНЫХ СКРЕЩИВАНИЯХ У КУКУРУЗЫ (Zea mays L.): АНАЛИЗ ПЛОИДНОСТИ ЭНДОСПЕРМА ВЫПОЛНЕННЫХ ЗЕРНОВОК
Л.И. МАВЛЮТОВА, Л.А. ЭЛЬКОНИН✉, А.Ю. КОЛЕСОВА
Важным компонентом апомиктичного размножения у растений служит способ-ность к формированию нередуцированных зародышевых мешков (ЗМ). Гетероплоидные скрещивания — эффективный инструмент для выявления таких ЗМ, поскольку при оплодо-творении диплоидных ЗМ пыльцой тетраплоидов в центральной клетке ЗМ происходит слияние двух диплоидных полярных ядер с диплоидным спермием, ведущее к восстановле-нию геномного баланса в эндосперме (2♀:1♂) и развитию полноценных зерновок. Ранее мы обнаружили, что на початках диплоидной линии кукурузы АТ, способной к гаплоид-ному партеногенезу, и ее гибридов при опылении пыльцой тетраплоидов формировались выполненные зерновки, из которых развивались диплоидные растения матроклинного типа и тетраплоидные гибриды. Нашей целью стала дальнейшая проверка гипотезы о возникно-вении выполненных зерновок в гетероплоидных скрещиваниях 2n × 4n на основе нередуци-рованных зародышевых мешков, образующихся у материнских линий, с помощью анализа плоидности эндосперма таких зерновок методом проточной цитометрии. В работе исполь-зовали выполненные зерновки, развившиеся на початках диплоидных линий кукурузы: АТ ГПЛ (2n), обладающей способностью к гаплоидному партеногенезу, 18-10-4 (2n), В47 (2n), Коричневый Маркер (КМ) (2n), Краснодарская 2 (2n), Краснодарская 9 (2n), Краснодарская 22 (2n), а также гибридов F1 и F3(В47/АT ГПЛ) (2n), F1(КМ1/Сахарная1) (2n) и F1(КМ/АТ ГПЛ) (2n), которые были опылены пыльцой тетраплоидных линий Тетра-Парий (ТП) (4n), Краснодарский тетраплоид (КрТ) (4n) и Черная Тетра (ЧТ) (4n). Скрещивания были проведены в 2022 году. Растения выращивали на опытном участке Селекционного комплекса ФАНЦ Юго-Востока (г. Саратов). Пыльцу с метелки каждого тетраплоидного растения стряхивали в индивидуальный чистый изолятор и наносили на рыльца початка диплоидного материнского растения. На 18-е сут после опыления с початков диплоидных линий собирали крупные выполненные зерновки, стерилизовали, отделяли эндосперм и фиксировали его в смеси спирта (95 %) и пропионовой кислоты (3:1) в течение 3 ч, отмы-вали в 70 % спирте и оставляли в нем на хранение при температуре -20 °C для последующе-го исследования плоидности с помощью проточной цитометрии. Зародыш помещали в пробирки на питательную агаризованную среду MS и выращивали в растильной комнате (фотопериод 16 ч день/8 ч ночь; 26±1 °C). Проростки с развитыми корнями переносили на несколько суток в пробирки с водой для адаптации к нестерильным условиям, после чего высаживали в теплицу в пластиковые сосуды и затем — на делянку экспериментального поля Селекционного центра ФАНЦ Юго-Востока. Для определения плоидности использо-вали кончики корешков растений, выращенных в пластиковых сосудах, на 12-е-14-е сут после высаживания в землю. Для каждого растения плоидность определяли на основании анализа 8-10 метафазных пластинок. При исследовании плоидности с помощью проточной цитометрии в качестве стандартов использовали ядра из листа гаплоидного растения линии АТ ГПЛ и из эндоспермов зерновок АТ ГПЛ и тетраплоидной линии Черная Тетра. У раз-ных линий и гибридов частота початков с выполненными зерновками варьировала от 7 до 75 %; частота выполненных зерновок от общего числа семян варьировала от 0,7 до 85,4 % и зависела от генотипа опылителя: при использовании ТП и ЧТ частота была значимо выше, чем для КрТ; частота початков с выполненными зерновками была наибольшей у ТП. Из выполненных зерновок, как показал цитологический анализ корневых меристем проростков, развивались диплоидные, триплоидные и тетраплоидные растения. В эндосперме вы-полненных зерновок было обнаружено несколько пиков флюоресценции, при этом 1-й пик наблюдался при значениях, в 2 раза превышающих таковые в эндосперме диплоидной линии (3С) и соответствовал 6С, аналогично показателю 1-го пика флюоресценции эндо-сперма тетраплоидной линии. Такой результат наблюдался у эндосперма зерновок, из которых были получены как тетраплоидные гибриды, так и диплоидные «матроклинные» растения. Кроме того, как в триплоидном, так и в гексаплоидном эндосперме наблюда-лись пики, соответствовавшие более высоким значениям плоидности (12С, 24С), которые были обусловлены процессами эндополиплоидизации. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о развитии выполненных зерновок в скрещиваниях 2n × 4n у кукурузы на основе нередуцированных ЗМ, важного компонента апомиксиса, и демонстрируют эф-фективность использования тетраплоидных опылителей для выявления таких зародышевых мешков у линий и гибридов кукурузы, в том числе в работах по созданию апомиктичных генотипов с помощью геномного редактирования. Кроме того, полученные результаты впервые подкрепляют балансовую теорию развития эндосперма прямыми экспериментальными доказательствами, поскольку плоидность эндосперма зерновок, формирующихся в гетероплоидных скрещиваниях, с помощью проточной цитометрии ранее не исследовалась.
Ключевые слова: апомиксис, гетероплоидные скрещивания, геномный баланс, проточная цитометрия.
L.I. Mavlyutova, L.A. Elkonin✉, A.Yu. Kolesova
An important component of apomictic reproduction in plants is the ability to form unreduced embryo sacs (ES). Heteroploid crosses are an effective tool for identifying such ESs, since when diploid ES is fertilized with tetraploid pollen, two diploid polar nuclei fuse with a diploid sperm, leading to the restoration of the genomic balance in the endosperm (2♀:1♂) and formation of normally developed seeds. Previously, we found that on the ears of the diploid AT maize line, capable of haploid parthenogenesis, as well as on the ears of its hybrids, when pollinated with pollen from tetraploids, plump kernels were formed, from which diploid maternal-type plants and tetraploid hybrids developed. Our aim was to further test the hypothesis on the formation of plump kernels in 2n × 4n heteroploid crosses from unreduced embryo sacs developed in maternal lines by analyzing the endosperm ploidy of such kernels using flow cytometry. In this study, we used the plump kernels developed on the ears of diploid maize lines: AT GPL (2n), which has the ability for haploid parthenogenesis, 18-10-4 (2n), V47 (2n), Korichnevyi Marker (KM) (2n), Krasnodarskaya 2 (2n), Krasnodarskaya 9 (2n), Krasnodarskaya 22 (2n), as well as the F1 and F3 hybrids V47/AT GPL (2n), F1 KM1/Sakharnaya1 (2n), and F1 KM/AT GPL (2n), which were pollinated with pollen of the tetraploid lines Tetra-Pariy (TP) (4n), Krasnodarskiy tetraploid (KrT) (4n), and Chernaya Tetra (ChT) (4n). The crosses were carried out in 2022. The plants were grown in the experimental field of the Federal Agricultural Research Centre of the South-East Region (Saratov, Russia). Pollen from the panicle of each tetraploid plant was shaken off into an individual clean parchment bag and applied to the stigmas of the ears of the diploid maternal plant. On the 18th day after pollination, large, mature kernels were collected from the ears of the diploid lines, sterilized, the endosperm was separated and fixed in a mixture of alcohol (95 %) and propionic acid (3:1) for 3 h, washed in 70 % alcohol and stored in 70 % alcohol at a temperature of -20 °C for subsequent ploidy analysis using flow cytometry. Embryos were placed in test tubes on MS agar nutrient medium, and grown in a growth room (photoperiod 16 h day/8 h night; 26±1 °C). Seedlings with developed roots were transferred to test tubes with water for several days to acclimate to non-sterile conditions, after which they were planted in plastic containers in a greenhouse and then in an experimental field of Federal Research Centre of Agriculture of South-East Region. Root tips from plants grown in plastic containers were used to determine ploidy on the 12th to 14th days after planting in the ground. For each plant, ploidy was determined based on the analysis of 8-10 metaphase plates. When studying ploidy using flow cytometry, nuclei from the leaf of the haploid plant of AT GPL line, and from the endosperms of AT GPL and tetraploid ChT kernels were used as standards. The frequency of ears with normally developed plump kernels varied from 7 % to 75 % among different lines and hybrids; the frequency of plump kernels from the total number of seeds varied from 0.7 to 85.4% and depended on the pollinator genotype: with TP and ChT, the frequency was significantly higher than for KrT; the frequency of ears with plump kernels was the highest for TP. Cytological analysis of the root meristems of seedlings showed that diploid, triploid, and tetraploid plants developed from the plump kernels. Several fluorescence peaks were detected in the endosperm of the plump kernels, with the first peak observed at values twice higher than those in the endosperm of the diploid line (3C) and corresponding to 6C, similar to the value of the first fluorescence peak of the endosperm of the tetraploid line. This result was observed in the endosperm of kernels from which both tetraploid hybrids and diploid "maternal-type" plants were obtained. Furthermore, peaks corresponding to higher ploidy values (12C, 24C) were also observed in both triploid and hexaploid endosperm, which were attributed to endopolyploidization processes. These data support the hypothesis that normally developed plump kernels develop in 2n × 4n maize crosses on the bases on unreduced ES, an important component of apomixis, and demonstrate the effectiveness of tetraploid pollinators to identify such embryo sacs in maize lines and hybrids, including in studies on the creation of apomictic genotypes using genome editing. Furthermore, the obtained results provide the first direct experimental evidence to support the balance theory of endosperm development, since the ploidy of endosperm of kernels formed in heteroploid crosses has not previously been studied using flow cytometry.
Keywords: apomixis, heteroploid crosses, genomic balance, flow cytometry.
ФГБНУ Федеральный аграрный научный центр Юго-Востока, |
Поступила в редакцию 22 марта 2025 года |
