doi: 10.15389/agrobiology.2022.5.945rus
УДК 633.15:577.336
Работа выполнена при поддержке ФНТП развития сельского хозяйства РФ (подпрограмма «Аграрная наука — шаг в будущее развитие АПК»).
ОЦЕНКА ВЗАИМОСВЯЗИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА
ЛИКОПИН-ε-ЦИКЛАЗЫ LcyE С СОДЕРЖАНИЕМ β-КАРОТИНА
И ХЛОРОФИЛЛОВ В ВЕГЕТАТИВНОЙ ТКАНИ КУКУРУЗЫ
Д.Х. АРХЕСТОВА1, 2, А.В. КУЛАКОВА1 ✉, Э.Б. ХАТЕФОВ3,
А.В. ЩЕННИКОВА1, Е.З. КОЧИЕВА1
Кукуруза (Zea mays L.) — важная сельскохозяйственная культура, одним из ценных признаков которой считается биосинтез предшественников витамина А в зерне и фотосинтезирующей ткани. Количество провитамина А в зерне находится в зависимости от экспрессии гена ликопин-ε-циклазы LcyE, катализирующей образование α-каротина и участвующей в регуляции соотношения ветвей b-b и b-e пути метаболизма каротиноидов. В настоящей работе впервые выявлено отсутствие ассоциаций между окраской зерна и содержанием суммы каротиноидов и β-каротина в листьях кукурузы, установлено наличие положительной связи между количеством β-каротина и хлорофиллов a и b, определена обратная зависимость между содержанием β-каротина и хлорофиллов a и b и уровнем экспрессии гена LycE. Целью работы был анализ корреляционной связи содержания суммы каротиноидов, β-каротина и хлорофиллов а и b с экспрессией гена LcyE в листьях инбредных линий кукурузы отечественной селекции. В работе использовали четыре инбредные линии кукурузы: три белозерные (6097-1, МБК, Тетраплоид Шумного) и одну (5580-1) с желтой окраской зерна. Зерна проращивали в увлажненной почве при 23/25 °С и режиме 16/8 ч (день/ночь) до появления 4-го настоящего листа. Суммарную РНК выделяли из 50-100 мг ткани листьев и использовали для синтеза кДНК (GoScriptтм Reverse Transcription System, «Promega», США). Экспрессию гена LcyE в листьях определяли методом количественной ПЦР в реальном времени с нормализацией данных по референсному гену Zea mays polyubiquitin (NM_001329666.1; праймеры ZmUBI-rtF: 5´-ATCGTGGTTGTGGCTTCGTTG-3´, ZmUBI-rtR: 5´-GCTGCAGAAGAGTTTTGG-GTACA-3´). Для реакции использовали 3 нг кДНК-матрицы, кДНК-специфичные праймеры (ZmLcyE-F: 5´-TTTACGTGCAAATGCAGTCAA-3´, ZmLcyE-R: 5´-TGACTCTGAAGCTAGAGAAAG-3´), набор Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX (ООО «Синтол», Россия) и термоциклер CFX96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad Laboratories», США). Проводили количественное определение содержания суммы каротиноидов, хлорофиллов а и b и β-каротина в листьях. Растительную ткань (0,2 г) гомогенизировали в растворе Фолча (хлороформ:метанол, 2:1 v/v) в присутствии следовых количеств Mg2CO3, инкубировали 1 ч при 4 °С в водяной бане со льдом и центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин и 4 °С (центрифуга Eppendorf 5418 R, «Eppendorf», Германия). Собирали хлороформную фазу и измеряли содержание ликопина, β-каротина, суммы каротиноидов, хлорофиллов а и b. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Eppendorf BioSpectrometer® basic («Eppendorf», Германия) и Cary 50 («Agilent Technology», США). Количество пигментов рассчитывали по соответствующим формулам. Корреляции между содержанием пигментов и экспрессией гена LcyE оценивали с помощью статистических методов. Самое высокое содержание каротиноидов было выявлено в листьях линии Тетраплоид Шумного. Образцы остальных трех линий синтезировали меньшее количество каротиноидов и были сходны между собой по этому параметру. В листьях линии 6097-1 было обнаружено приблизительно в 2 раза больше β-каротина и хлорофиллов a и b, чем у других анализируемых линий, несущественно различающихся между собой по количеству пигментов. Поскольку b-каротин служит предшественником ксантофиллов основного ксантофиллового цикла фотозащиты растений, можно говорить о повышенной скорости фотосинтеза в фотосинтезирующих тканях линии 6097-1 в сравнении с другими анализируемыми линиями. Соответственно, линия 6097-1 может обладать повышенной устойчивостью к оксидативному стрессу, а также служить донором признака повышенного содержания провитамина А (как силосная культура). Также установлено, что в листьях линий 5580-1 и Тетраплоид Шумного экспрессия гена LycE в ~ 4-5 раз выше, чем у линий МБК и 6097-1. Корреляционный анализ показал обратную зависимость между содержанием β-каротина и хлорофиллов a и b и уровнем экспрессии гена LycE. На основании полученных результатов мы предполагаем, что данные экспрессии гена LycE могут быть использованы в качестве экспрессионного молекулярного маркера количества провитамина А, синтезируемого в листьях кукурузы, а также при оценке степени устойчивости растения к фотоокислительному стрессу.
Ключевые слова: Zea mays L., кукуруза, ликопин-ε-циклаза, LycE, каротиноиды, хлорофиллы, экспрессия генов.
D.Kh. Arkhestova1, 2, A.V. Kulakova1 ✉, E.B. Khatefov3,
A.V. Shchennikova1, E.Z. Kochieva1
Maize (Zea mays L.) is an important world crop. One of the valuable traits of this plant is the biosynthesis of vitamin A precursors in kernel (dietary nutrition) and photosynthetic tissue (protection of the plant from stress; silage with increased dietary value). The amount of synthesized provitamin A in kernel depends on the level of expression of the lycopene-ε-cyclase LcyE gene, which catalyzes the formation of α-carotene and is involved in the regulation of the ratio of b-b and b-e fluxes of carotenoid metabolism. The aim of the study was to analyze the correlation between the content of the sum of carotenoids, β-carotene, and chlorophylls a and b with the expression of the LcyE gene in the leaves of inbred maize lines of domestic selection. To achieve the goal, four inbred maize lines were used in the study: three white-grained (6097-1, MBK and Shumny's Tetraploid) and one (5580-1) with yellow grain color. Expression of the LcyE gene in leaves was determined by quantitative real-time PCR. Quantitative determination of the amount of carotenoids, chlorophylls a and b, and β-carotene in leaves was carried out spectrophotometrically using the Folch method. Correlations between pigment content and LcyE gene expression were evaluated using statistical methods. As a result, we assessed a possible correlation between the activity of the LcyE gene and the content of carotenoids and chlorophylls in the photosynthetic tissue of four maize lines: three white-grained (6097-1, MBC and Shumnoy Tetraploid) and one (5580-1) with yellow-colored kernel. Quantification of carotenoids revealed the highest content of these pigments in the leaves of the Tetraploid Shumny line. The accessions of the remaining three lines synthesized a smaller amount of carotenoids and were similar to each other in this parameter. At the same time, β-carotene, as well as chlorophylls a and b, were most of all contained in the leaves of line 6097-1 — approximately 2 times more than in other analyzed lines, where the pigment content did not differ significantly. Thus, the absence of associations between the color of the kernel and the content of the b-carotene and sum of carotenoids in maize leaves was confirmed. On the other hand, the obtained data suggest a positive relationship between the amount of β-carotene and chlorophylls (a and b). It is possible to assume an increased rate of photosynthesis in the photosynthetic tissues of line 6097-1 in comparison with other analyzed maize lines. Accordingly, line 6097-1 may have an increased resistance to oxidative stress, as well as be a donor of a trait with an increased content of provitamin A (as a silage crop). The expression of the lycopene-ε-cyclase LycE gene was determined in the same leaf tissues. It was shown that the LycE gene was expressed ~ 4-5 times higher in the leaves of accessions of lines 5580-1 and Tetraploid Shumny than in the leaves of accessions of lines MBK and 6097-1. Correlation analysis showed an inverse relationship between the content of β-carotene and chlorophylls (a and b) and the level of LycE gene expression. Thus, in this study, for the first time, we assessed a possible correlation between the activity of the LcyE gene and the content of carotenoids and chlorophylls in the photosynthetic tissue of white and yellow grain maize lines of domestic selection. No associations were found between grain color and the content of total carotenoids and β-carotene in maize leaves. A positive relationship was found between the amount of β-carotene and chlorophylls a and b. For the first time, an inverse relationship between the content of β-carotene and chlorophylls a and b and the level of LycE gene expression was determined. The possibility of using data on the expression of the LycE gene in the leaf as an expression molecular marker of the amount of provitamin A synthesized in the leaves, as well as the degree of plant resistance to photooxidative stress, was demonstrated. The data obtained can be used in maize breeding to search for donors of the trait of increased content of provitamin A in the leaves.
Keywords: Zea mays L., maize, lycopene-ε-cyclase, LycE, carotenoids, chlorophylls, gene expression.
1ФИЦ Фундаментальные основы биотехнологии РАН, |
Поступила в редакцию |
