БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2021.5.910rus

УДК 579.6:575

Работа выполнена в соответствии с Государственным заданием на оказание государственных услуг по Разделу 5. «Защита и биотехнология растений» Программы ФНИ государственных академий наук на 2013-2020 гг., тема 15 «Молекулярно-биологические и нанотехнологические основы разработки биологических и химических средств защиты растений нового поколения в целях эффективного и безопасного их использования в интегрированных системах защиты».

 

О ДРИМ-ГЕНОТИПИРОВАНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИОЗОВ
КАРТОФЕЛЯ ИХ АНТАГОНИСТОВ И БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ
ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ И ЭКОЛОГИИ

В.П. ТЕРЛЕЦКИЙ1, 2, А.М. ЛАЗАРЕВ1, И.И. НОВИКОВА1,
И.В. БОЙКОВА1, В.Н. ЗЕЙРУК3

Сохранение окружающей среды при интенсификации сельскохозяйственного и промышленного производства связывают с развитием экотехнологий, в том числе с биоконтролем патогенов растений и биоремедиацией. Микроорганизмы — продуценты биопрепаратов и деструкторы углеводородов характеризуются высокой спонтанной вариабельностью, что может приводить к изменению их активности, поэтому при стабилизирующем отборе необходимо периодически подтверждать их штаммовую принадлежность. Молекулярно-генетические методы исследований дают возможность идентифицировать возбудителей заболеваний c полной характеристикой их наследственного материала. В этой работе представлены данные о применении разработанного нами метода двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) для изучения генетических профилей бактерий-фитопатогенов родов Pseudomonas, Pectobacterium и их антагонистов Bacillus subtilis (Bs), подтверждена высокая биологическая эффективность двух отселектированных штаммов Bs (М-22 и И5-12/23) против бактериальных болезней картофеля при хранении клубней в производственных условиях. Также впервые выполнена генетическая идентификация (паспортизация) штаммов бактерий-деструкторов рода Pseudomonas, пригодных для решения природоохранных задач. Цель исследований заключалась в оценке генетического разнообразия бактерий нескольких родов для отбора наиболее эффективных штаммов-антагонистов и штаммов-деструкторов. Примененный нами метод генотипирования основан на использовании двух эндонуклеаз рестрикции для расщепления геномной ДНК бактерии. Присутствующая в реакционной смеси ДНК-полимераза (Taq) обеспечивает мечение фрагментов ДНК биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом (Bio-dCTP). Метка включается только в ДНК, имеющую 3¢-усеченные концы, которые образует первый ферментом. Вторая эндонуклеаза рестрикции дает только тупые концы фрагментов, которые не способны присоединять метку. В результате переноса на фильтр визуализируются 20-50 четко различимых фрагментов ДНК, число и распределение которых характерно для каждого бактериального штамма. Генотипирование двух близкородственных штаммов Pectobacterium atrosepticum позволяет распознать около 50 фрагментов ДНК, более 20 % которых специфичны для одного из сравниваемых штаммов. Мы использовали две пары эндонуклеаз рестрикции — XbaI/DraI и XbaI/Eco24I; полученные результаты указывают на одинаковую дискриминационную способность ферментов при сопоставлении штаммов P. atrosepticum Д822 и Г784 по генетическим профилям. При генотипировании бактерий рода Pseudomonas оптимальной была пара BcuI/Eco32I, для Bs первая рестриктаза — SgsI (39 сайтов расщепления), вторая (уменьшает размер получаемых фрагментов ДНК) — Eco32I. Методом ДРИМ получены генетические профили микроорганизмов родов Pectobacterium и Pseudomonas, характеризующие индивидуальность каждого штамма. Отмечены существенные генетические различия между видами Ps. fluorescens и Ps. marginalis. При этом выявлены идентичные фрагменты ДНК, что указывает на родовую филогенетическую близость этих видов. При искусственном заражении клубней установлена высокая антагонистическая активность Bs И5-12/23 в отношении штаммовP. atrosepticumи P. сarotovorum subsp. catovorum. Подтверждена высокая биологическая эффективность двух отселектированных штаммов Bs (М-22 и И5-12/23) против бактериальных болезней картофеля при хранении клубней. Штамм BsИ5-12/23 обладал более выраженной антагонистической активностью против возбудителей мягкой бактериальной и кольцевой гнилей, а также фузариоза. При хранении обработка штаммами-антагонистами снижала пораженность почти вдвое по сравнению с контролем (30,4-35,5 % здоровых клубней против 13,3 %). По результатам генотипирования биодеструкторов рода Pseudomonas сформирована коллекция штаммов, утилизирующих трудноокисляемые соединения, включая тяжелые фракции нефти и полиароматические углеводороды (бензопирен, хризен, фенантрен, антрацен, хризен, нафталин), что позволяет составлять ассоциации штаммов-деструкторов для утилизации конкретных загрязнителей. Таким образом, ДРИМ-генотипирование позволяет идентифицировать бактериальные штаммы для подтверждения их происхождения при разработке и применении биопрепаратов различного назначения.

Ключевые слова: эндонуклеазы рестрикции, генотипирование, фитопатогены, микробы-антагонисты, биодеструкторы, Pectobacterium, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Solanum tuberosum L., картофель.

 

 

ON DDSL-BASED GENOTYPING OF POTATO BACTERIOSIS AGENTS, THEIR ANTAGONISTS AND MICROBIAL BIODESTRUCTORS FOR PLANT PROTECTION AND ECOTECHNOLOGIES

V.P. Terletskiy1, 2 , A.M. Lazarev1, I.I. Novikova1, I.V. Bojkova1,
V.N. Zeyruk3

Intensification of agricultural and industrial production necessitates environmentally friendly technologies to prevent human habitat from chemical pollutions. Microbial producers of biologicals for biocontrol of plant pathogens and hydrocarbon destructors for bioremediation are characterized by high spontaneous genetic variability which can lead to a change in their activity. Therefore, in stabilizing selection, it is necessary to confirm strain affiliation. Here, we presents data on the application of the double digest and selective label (DDSL) technique developed by us to study the genetic profiles of plant pathogenic agents of the genera Pseudomonas, Pectobacterium, their antagonists Bacillus subtilis (Bs), and the hydrocarbon destructors of the genus Pseudomonas. The study confirmed high biological efficiency of two selected Bs strains, the M-22 and I5-12/23 against bacterial diseases of stored potato tubers. In addition, destructors from the genus Pseudomonas were genetically identified. The aim of the study was to evaluate genetic diversity among Pseudomonas, Pectobacterium, and Bs strains to select effective microbial antagonists and hydrocarbon destructors. The DDSL technique uses two restriction endonucleases for bacterial genomic DNA digestion. Taq DNA polymerase supplemented into reaction mix provides simultaneous labeling DNA fragments by biotinylated deoxycytidine triphosphate (Bio-dCTP). Only fragments digested with one of the restriction enzymes producing fragments with 3´-recessed ends are subjected to labeling. The second restriction enzyme produces only blunt ends which can not bind Bio-dCTP tag. As a result of DDSL reaction 20 to 50 clear DNA fragments are visualized on the filter, and their quantity and distribution are characteristic for each bacterial strain. Genotyping allows generating genetic profile for each bacterial strain, i.e., assigning a “bar-code” to the bacteria that identifies a given microbe with confidence. Genotyping P. atrosepticum D822 и G784 allows for identification of about 50 DNA fragments more than 20 % of which were specific for only one of the compared strains. We used two pairs of restriction enzymes — XbaI/DraI and XbaI/Eco24I. Our results indicate on equal discriminatory ability of these two enzyme combinations when compared P. atrosepticum strains D822 и G784. We noted some advantage of XbaI/DraI enzymes because of its ability to identify differences in genetic profiles in a range of longer DNA fragments. The optimal enzymes for Pseudomonas genus genotyping were restriction endonucleases BcuI/Eco32I, for Bs the first restriction enzyme was SgsI (39 cleavage sites), the second was Eco32I reducing the size of the obtained DNA fragments. High antagonistic activity of B. subtilis strain I5-12/23 which belongs to I genotypic group was shown in laboratory experiments with artificial contamination of potato tubers with P. atrosepticum 1944 и P. carotovorum subsp. carotovorum 481. Index of development of bacterial soft rot disease after treatment of infected tubers by B. subtilis strain I5-12/23 was 0-0.02, in control the index was 4.04. Biological activity of this strain after treatment of infected tubers was up to 100 % whereas chemical fungicide Maxim KS gave rise to only 77.7 % value. Experiments conducted in potato storage houses confirmed high biological activity of two selected bacillus strains against bacterial diseases during potato tuber storage. B. subtilis strain I5-12/23 demonstrated highly expressed antagonistic activity against causal agents of bacterial soft rot, ring rot as well as fusarium dry rot potato diseases. Significant suppression of potato tuber diseases in comparison with control after treatment by selected antagonist strains was demonstrated, and this effect was comparable with that of chemical standard Maxim KS. Percentage of healthy tubers treated by bacillus strains was in the range of 30.4-35.5 % whereas in control this value did not exceed 13.3 %. Thus, yield of healthy products compared to control was 2.7 times higher. The most efficient B. subtilis strain I5-12/23 effectively suppressed causal agents for ring rot and fusarium dry rot potato diseases. Prevalence of ring rot disease was 2.6-2.9 %, fusarium dry rot — 1.5-3.0 %, the values which are significantly lower than those in samples treated by B. subtilis М-22 and Maxim KS (4.8 and 3.5 %; 9.0 and 4.1 %, respectively). After genotyping, destructor strains of the genus Pseudomonas utilizing difficult-to-oxidize compounds, including heavy oil fractions and polyaromatic hydrocarbons (benzopyrene, chrysene, phenanthrene, anthracene, chrysene, naphthalene) have been deposited in the VIZR collection. The range of their activity is enough to compose associations for utilizing specific pollutants. Thus, DREAM genotyping identifies bacterial strains to confirm their origin in the course of development and use of biological products for various purposes.

Keywords: restriction endonucleases, genotyping, plant pathogens, microbial antagonists, biodestructors, Pectobacterium, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Solanum tuberosum L., potato.

 

 

1ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений,
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,
ш. Подбельского, 3,
е-mail: valeriter@mail.ru ✉, allazar54@mail.ru, irina_novikova@inbox.ru, irina_boikova@mail.ru;
2ГАОУ ВО ЛО Ленинградский государственный
университет им. А.С. Пушкина,

196605 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,
ш. Петербургское, 10,
е-mail: valeriter@mail.ru;
3ФГБНУ Всероссийский НИИ картофельного
хозяйства им. А.Г. Лорха,

140051 Россия, Московская обл., Люберецкий р-н,
п. Красково, ул. Лорха, 23, литера «В»,
e-mail: vzeyruk@mail.ru

Поступила в редакцию
9 июля 2021 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML