doi: 10.15389/agrobiology.2018.5.938rus
УДК 633.521:581.1:581.4
ОТВЕТНАЯ РЕАКЦИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ in vitro КЛЕТОК
Linum grandiflorum Desf. НА ДЕЙСТВИЕ КАДМИЯ И ГЛИФОСАТА
Е.А. ГОНЧАРУК1, Т.Н. НИКОЛАЕВА1, Л.В. НАЗАРЕНКО2,
Е.А. КАЛАШНИКОВА3, Н.В. ЗАГОСКИНА1
Работ по культуре льна крупноцветкового (Linum grandiflorum Desf.) in vitro крайне мало и в них преимущественно рассматривается морфогенез, получение эмбриокультуры, резистентность клеточных линий. L. grandiflorum относится к декоративным культурам, подвергающимся воздействию разнообразных стрессовых факторов в условиях города. К их числу относятся поллютанты и гербициды, вызывающие окислительный стресс в растениях. Выполненное нами исследование впервые показывает различия в реакции in vitro культивируемых клеток льна крупноцветкового на действие двух стрессовых факторов — тяжелого металла кадмия и пестицида глифосата (по морфофизиологическим характеристикам и биосинтезу фенольных соединений). Целью работы была оценка ростовой активности каллусной культуры льна крупноцветкового и накопления в ней фенольных соединений, в том числе фенилпропаноидов и флавоноидов, при воздействии токсических агентов. Каллусные культуры выращивали на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2 % сахарозы и 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Чтобы оценить влияние стрессоров, в основную питательную среду добавляли кадмий Cd(NO3)2 (60 мкМ), глифосат (10 мкМ) или кадмий и глифосат одновременно (в тех же концентрациях). Контролем служила обычная питательная среда. Каллусные культуры анализировали в конце пассажа (28-е сут культивирования). Учитывали интенсивность роста каллусов и их морфофизиологические характеристики. Содержание воды в каллусных тканях определяли стандартным методом после высушивания до постоянной массы в термостате при температуре 70 °С. Фенольные соединения извлекали 96 % этанолом из замороженного жидким азотом растительного материала при -196 °С. Содержание суммы растворимых фенольных соединений определяли с реактивом Фолина-Дениса, флавоноидов — с 1 % раствором AlCl3 при λ = 725 нм и λ = 415 нм. Количество фенилпропаноидов оценивали методом прямой спектрофотометрии экстрактов при λ = 330 нм. Для изучения состава фенольного комплекса каллусных культур льна применяли метод тонкослойной хроматографии на пластинках целлюлозы, растворитель БУВ (н-бутанол + уксусная кислота + вода в соотношении 40:12:28). Каллус L. grandiflorum имел рыхлую консистенцию, желтовато-зеленоватый цвет, невысокий индекс роста (к концу пассажа 150 %) и высокую оводненность (95-97 %). По мере его роста содержание суммы фенольных соединений и фенилпропаноидов (биогенетически ранних полифенолов) возрастало (к концу пассажа в 2,7 раза). Количество флавоноидов, одних из наиболее распространенных представителей фенольного метаболизма, в первой половине цикла культивирования повышалось (в 2,25 раза), а к концу пассажа незначительно снижалось. В условиях действия кадмия на поверхности каллусных культур отмечалось формирование некротизированных клеток, окрашенных в темный цвет, что не было характерно для варианта с глифосатом. Биосинтетическая способность каллусных культур при действии кадмия не изменялась. Суммарное накопление фенольных соединений, количество фенилпропаноидов и флавоноидов было практически равным таковому в контроле. При действии глифосата содержание этих вторичных метаболитов, особенно флавоноидов, в культурах уменьшалось. При комплексном воздействии кадмия и глифосата суммарное содержание фенольных соединений возрастало на фоне снижения количества фенилпропаноидов и флавоноидов. Полученные данные свидетельствуют о различиях в ответной реакции клеток льна крупноцветкового на действие стрессовых факторов, что проявляется как в их морфофизиологических характеристиках, так и при биосинтезе фенольных соединений.
Ключевые слова: лен крупноцветковый, Linum grandiflorum, каллусная культура, устойчивость, кадмий, глифосат, фенольные соединения, фенилпропаноиды, флавоноиды.
E.A. Goncharuk1, T.N. Nikolaeva1, L.V. Nazarenko2, E.A. Kalashnikova3, N.V. Zagoskina1
Scholarly papers on in vitro culture of large-flowered flax (Linum grandiflorum Desf.), an ornamental crop for urban gardening, are very few and mainly elaborate morphogenesis, embryo culture, and cell line resistance issues. Heavy metals and herbicides are typical urban pollutants which cause oxidative stress. Our study for the first time reveals differences in morphophysiological characteristics and biosynthesis of phenolic compounds between in vitro cultured flaxseed cells influenced by Cd and herbicide glyphosate. With the aim to specify the mechanisms involved in stress tolerance of L. grandiflorum we have estimated the accumulation of antioxidants of phenolic nature, including phenylpropanoids and flavonoid in the callus culture. When studying the effect of stress factors, cadmium (60 μM), glyphosate (10 μM) or cadmium and glyphosate simultaneously (in the same concentrations) were added to the nutrient medium. Control was the standard nutrient medium. Callus cultures were analyzed at the end of the passage (day 28 of culture). Phenolic compounds extracted with 96 % ethanol from a plant material frozen with liquid nitrogen at -196 °C. The content of the sum of soluble phenolic compounds was determined with a Folin-Denis reagent, flavonoids with a 1 % solution of AlCl3 at 725 and 415 nm. The concentration of phenylpropanoids was determined by direct spectrophotometric analysis of the extracts at 330 nm. To study the composition of the callus flax cultures phenolic complex compounds, the method of a thin layer chromatography on cellulose plates, solvent BUW (n-butanol + acetic acid + water in the ratio 40:12:28) were used. Callus of L. grandiflorum had a loose consistency, yellowish-green color, low growth index (by the end of the passage — 150 %) and high water content (95-97 %). As it grows, the content of soluble phenolic compounds and phenylpropanoids (biogenetically early polyphenols) increased 2.7 times by the end of the passage. The content of flavonoids, one of the most common representatives of phenolic compounds, in the first half of the cultivation cycle increased 2.25 times, and by the end of the passage slightly decreased. The application of cadmium caused the formation of dark colored necrotic cells on the surface of callus. In contrast, the application of glyphosate did not give such reaction. The application of cadmium did not affect the biosynthetic capacity of callus cultures in terms of the total accumulation of phenolic compounds, phenylpropanoids and flavonoids, the quantity of which was almost equal to that of the control. Under the application of glyphosate, however, the level of these secondary metabolites in cultures decreased, especially flavonoids. Under the simultaneous use of cadmium and glyphosate the total content of phenolic compounds in calluses increased, but we observed the decrease in the amount of phenylpropanoids and especially flavonoids. The data obtained show the differences in the response of large-flowered flax cells to the effect of stress factors on their morphology and the level of biosynthesis of phenolic compounds, the substances with high biological and antioxidant activity.
Keywords: large-flowered flax, Linum grandiflorum, callus cultures, tolerance, cadmium, glyphosate, phenolic compounds, phenylpropanoids, flavonoids.
1ФГБУН Институт физиологии растений |
Поступила в редакцию |
