doi: 10.15389/agrobiology.2018.5.947rus

УДК 632.3:635.263:578.85/.86:578.2:577.217

Работа выполнена в рамках научно-исследовательского проекта «Исследование молекулярных механизмов супрессии РНК-сайленсинга вирусами растений (на модели вирусного комплекса шалота и вируса шарки сливы)» (Госзадание № 0574-2015-0003 на 2017 год).

 

ИНДУКЦИЯ PTI (PATTERN-TRIGGERED IMMUNITY)
И ТРАНСКРИПЦИОННОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ
 ПРИ ПЕРСИСТЕНТНОЙ АЛЛЕКСИВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

А.В. АРХИПОВ, В.К. ВИШНИЧЕНКО

Растения обладают сложной антивирусной иммунной системой, в функционировании которой ключевую роль играет РНК-сайленсинг — индуцибельный молекулярный механизм, контролирующий уровень репликации вируса и степень выраженности симптомов. В ряде случаев сайленсинг подавляется при действии вирусных белков-супрессоров, предотвращающих фрагментацию или блокирование трансляции вирусных РНК. Активность белков-супрессоров считают непременным условием успешной репродукции фитовирусов. В то же время РНК-сайленсинг нельзя рассматривать исключительно как беспощадный антивирусный механизма, действие которого необходимо полностью подавить, в действительности, по-видимому, происходит тонкая регуляция этого процесса. Известно, что многие фитовирусы кодируют супрессоры, обладающие очень слабой или преходящей активностью (transiently active suppressors). В частности Х вирус шалота (ХВШ), прототип рода Allexivirus, успешно репродуцируется и формирует персистентную инфекцию в отсутствие активного белка-супрессора и, следовательно, преодолевает иммунный барьер сайленсинга с помощью иного механизма. Основываясь на полученных в последние 2-3 года экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что фитовирусы (подобно бактериальным патогенам) индуцируют процесс, аналогичный классическому PTI (Pattern-triggered immunity), мы предположили, что таким механизмом может быть обусловленное PTI специфическое транскрипционное репрограммирование. Наши предварительные результаты свидетельствовали в пользу этой гипотезы (А.В. Архипов с соавт., 2017): инфекция ХВШ оказалась сопряженной с подавлением экспрессии по меньшей мере двух факторов сайленсинга (DCL-белков и RDR) в корнях и листьях инфицированных растений. Задачей настоящей работы была экспериментальная проверка предложенной нами гипотезы методом ПЦР в реальном времени с использованием более широкого спектра генов-мишеней, включающего 10 классических маркеров PTI и ряд генов, продукты экспрессии которых участвуют в репродукции фитовирусов (TCTP-комплекс). В работе впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие об индукции PTI в растениях шалота (Allium cepa L. var. aggregatum L.G. Don) в условиях персистентной вирусной инфекции и об участии этого механизма в транскрипционном репрограммировании; показано, что в результате в инфицированных растениях шалота подавляется экспрессия всех факторов сайленсинга и некоторых R-генов (например, гомологов гена Tm22, NB-LRR рецепторов). Также нами выявлена группа генов, уровень экспрессии которых в исследуемой патосистеме существенно повышен по сравнению со здоровыми растениями: SOBIR— log10RQ ~ 1,0; ARM (гены, кодирующие белки armadillo) — log10RQ ~ 2,0; PR1 — log10RQ ~ 2,0; PR5 — log10RQ ~ 4,0 (!); Pathogenesis-related protein 14 = nsLTP — log10RQ ~ 2.0. Таким образом, Х вирус шалота индуцирует динамический и скоординированный процесс транскрипционного репрограммирования в корнях и листьях инфицированных растений; при этом подавление экспрессии всех факторов РНК-сайленсинга (особенно белков-аргонавтов) и ряда NB-LRR рецепторов, по-видимому, и обусловливает успешность формирования состояния персистентной вирусной инфекции. Одно из важнейших направлений дальнейших исследований молекулярных механизмов антивирусного фитоиммунитета — идентификация специфических антивирусных PRR (Pattern recognition receptors) растительной клетки и выяснение молекулярных механизмов взаимодействия этих рецепторов с репликативными (двуцепочечными) формами вирусных РНК (вирусными PAMPs): именно этот процесс определяет качественные и количественные параметры транскрипционного репрограммирования в растениях при вирусной инфекции. Клонирование и межвидовой перенос антивирусных PRR растительной клетки может оказаться перспективной технологией создания новых форм сельскохозяйственных растений, обладающих высокой и длительной резистентностью к широкому спектру вирусных патогенов (D. Bao с соавт., 2017).

Ключевые слова: аллексивирусы, Х вирус шалота, Allium cepa L. var. aggregatum L.G. Don, персистентная инфекция, РНК-сайленсинг, врожденная иммунная система растений, Pat-tern-triggered immunity (PTI), транскрипционное репрограммирование.

 

Полный текст

 

 

PATTERN-TRIGGERED IMMUNITY (PTI) INDUCTION AND
TRANSCRIPTIONAL REPROGRAMMING IN PERSISTANT
ALLEXIVIRUS INFECTION

A.V. Arkhipov, V.K. Vishnichenko

In virus—plant interactions, one of the major mechanisms for plant antiviral immunity relies on RNA silencing, which is often suppressed by co-evolving viral suppressors, thus enhancing viral pathogenicity in susceptible hosts. However RNA silencing should not only be viewed as an antiviral mechanism that must be counteracted. In fact, many viruses encode weak or transiently active suppressors and probably do not use these viral proteins for control RNA silencing; for example, Shallot virus X (ShVX) do not code the active silencing suppressor and consequently use the another molecular mechanism to overcome the silencing immune barrier, establish the persistent infection and prevent catastrophic damage to its host. We hypothesized that this “non-suppressor” mechanism is the process of transcriptomic reprogramming (TRP) induced by the PTI (pattern-triggered immunity), the first layer of plant defence, which is triggered by specific recognition of conserved microbe- or pathogen-associated molecular patterns (MAMPs, or PAMPs, respectively) by pattern recognition receptors (PRRs) at the plasma membrane and the induction of defense signaling. Recently a role of PTI in antiviral defence has been demonstrated in Arabidopsis by showing that mutants in the PRR (PRRs, Pattern recognition receptors) coreceptor kinases exhibit increased susceptibility to different RNA viruses. Our preliminary results confirm this hypothesis and show that there is a negative correlation between the ShVX reproduction rates and the levels of RNA-dependent RNA-polymerase (RDR) and DCL proteins in roots and leaves of infected shallot plants. The task of this study is the experimental verification of our PTI-induced TRP hypothesis by quantitative real-time PCR (Comparative CT experiment, delta-delta CT algorithm; calibrator: healthy shallot seedlings; normalizer: 18S RNA; The 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems, USA) to evaluate in vivo expression levels of transcripts coding PTI markers, factors of RNA-silencing, NB-LRR receptors and complex of TCTP-PIRL-GRF6-DBP1 proteins in the healthy and ShVX-infected shallot (Allium cepa L. var. aggregatum L.G. Don) plants. In this study for the first time we obtained the convincing data about PTI and TRP induction in ShVX-infected shallot plants. As result of TRP, repression of all factors of RNA-silencing, some NB-LRR receptors (e.c., Tm22) and some proteins of TCTP-PIRL-GRF6-DBP1 complex take place in this virus—plant system. On the other hand, group of defense genes with high expression levels has been discovered in this system: SOBIR — log10RQ ~ 1.0; ARM (genes encoding armadillo protein family) — log10RQ ~ 2.0; Pathogenesis-related protein 1, PR1 — log10RQ ~ 2.0; Pathogenesis-related protein 5, PR5 — log10RQ ~ 4.0 (!); Pathogenesis-related protein 14 = nsLTP — log10RQ ~ 2.0. So, in leaves and roots of infected plants ShVX programs dynamical and coordinated process of TRP and downregulation of genes coding for core RNAi components and disease resistance proteins might be correlated with successful virus reproduction and persistent virus infection establishment. We are of opinion that plant viral-specific PRRs identification, plant viral PAMP-triggered PTI and PRR (Pattern recognition receptors)-mediated transcriptomic reprogramming mechanisms ascertainment are the main tasks of coming antiviral plant immunity research period. Сloning of plant PRRs involved in plant virus PAMPs recognition, and the inter-species transfer of plant virus-sensing PRRs are the promising future technologies for broad spectrum antiviral resistant plants creation (D. Bao et al., 2017).

Keywords: allexiviruses, Shallot virus X, Allium cepa L. var. aggregatum L.G. Don, persistant infection, RNA-silencing, plant innate immune system, Pattern-triggered immunity (PTI), transcriptomic reprogramming.

 

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной 
биотехнологии, 

127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, e-mail: iab@iab.ac.ru, batler51@yandex.ru, vish@iab.ac.ru

Поступила в редакцию
21 февраля 2018 года

 

назад в начало