УДК 633.15:631.52/.524

СОЗДАНИЕ ГАПЛОИНДУКТОРОВ КУКУРУЗЫ: ТРИ ЦИКЛА ОТБОРА НА ВЫСОКУЮ ЧАСТОТУ ИНДУКЦИИ МАТРОКЛИННЫХ ГАПЛОИДОВ

О.А. ШАЦКАЯ

С использованием гибридизации исходных метчиков, выявления индивидуальных растений с высокой частотой индукции и трех циклов отбора в 14 поколениях гибридного образца (РЕМ 48II x ЗМ 97)F1 созданы гаплоиндукторы кукурузы ЗМК 1, ЗМК 1У и ЗМК 3 с высокой частотой индукции гаплоидов — соответственно 5-7, 8-13 и 10-14 %. Высокоэффективные гаплоиндукторы ЗМК значительно расширяют возможности использования метода гаплоидии в селекционных программах по получению гомозиготных линий кукурузы.

Ключевые слова: кукуруза, зародышевый маркер, матроклинные гаплоиды, частота индукции гаплоидов, индукторы, отбор.

 

Последние 15 лет метод ускоренного создания гомозиготных автодиплоидных линий из гаплоидов кукурузы, полученных в условиях in vivo, широко используется в мировой селекции, на что указывают данные литературы (1-3) и информация Интернет-сайтов ведущих селекционных фирм PIONEER (США) (4) и Great Lakes Hybrids (США) (5). Такая возможность появилась благодаря созданию эффективных гаплоиндукторов для массового получения гаплоидов (1-3, 6-8) и усовершенствованию способов удвоения числа хромосом в клетках гаплоидных проростков (1, 8). Возникновение гаплоидного спорофита матроклинного (материнского) типа происходит в результате развития зародыша с гаметическим числом хромосом (Zeamays L., n = 10) из неоплодотворенной яйцеклетки. S.S. Chase (9), а затем и многие другие авторы (6, 10-12) показали, что возникновение гаплоидов находится под генетическим контролем и при скрещивании двух форм определяется обоими (как мужским, так и женским) родителями. В 1960-е годы частота возникновения гаплоидов при скрещивании с известным метчиком Purple Embryo Marker (РЕМ) составляла 1,054 на 1000 проанализированных зерновок, или 0,11 %, а линия Stock 6, обнаруженная E.H. Coe, в потомстве давала 3,23 % гаплоидов (10). Передачу высокой гаплоидной индукции от Stock 6 в гибрид (Stock 2 x Stock 6)F1BC1 продемонстририровали K.R. Sarkar с соавторами (1972); два цикла тестирования и отбора гибридного материала усилили гаплоидную индукцию (возрастание частоты с 0,60 до 1,33 %) (11). P. Lashermts и M. Beckert (7) в результате самоопыления гибрида W 23 x Stock 6 получили линию WS 14, которая индуцировала матроклинные гаплоиды с частотой 2-5 %. В 1990-е годы в разных странах были созданы гаплоиндукторы с участием метчиков РЕМ и Stock 6, стимулирующие возникновение матроклинных гаплоидов с высокой частотой: ЗМС 8 (Россия) — 3-8 % (цит. по 13), ЗМК 1У (Россия) — 3-10 % (1), МНI (Молдова) – 6-8 % (2), RWS (Германия) — 8 % (цит. по 3). В настоящей статье образцы кукурузы с генами окраски A1C1R1-nj:cudu будут обозначены иностранным термином «маркер» и русскоязычным — «метчик», а обладающие гаплоиндуцирующей спсобностью — термином «гаплоиндуктор».

Механизм индукции развития неоплодотворенной яйцеклетки в гаплоидный зародыш в настоящее время раскрыт не до конца. Предполагается, что нарушения в микроспорогенезе могут быть одним из факторов индукции. Н.Х. Еналеева с соавт. (13) проводили эмбриологический анализ завязей с початков кукурузы, зафиксированных через 32-96 ч после опыления пыльцой линии-гаплоиндуктора ЗМС 8. По результатам анализа был сделан вывод, что индуцирующая способность этой линии обусловлена мутацией, которая приводит к дефектности функций мужских гамет (отсутствие подвижности, неспособность к слиянию с женскими ядрами) и, как следствие, — к нарушению двойного оплодотворения. Оплодотворение только центральной клетки зародышевого мешка и развитие эндосперма может индуцировать деление неоплодотворенной яйцеклетки. С.Т. Чалык (2) отмечает высокую частоту (11,0-14,7 %) микроспороцитов в варианте с индуктором гаплоидов MHI и предполагает, что анеуплоидные гаметы могут быть причиной нарушения двойного оплодотворения.

 Для выявления гаплоидов, кроме маркированных проростков, успешно используют генетическую маркерную систему окраски сухой зерновки с участием генов A1C1R1-nj:cudu, созданную D.K. Nanda с соавт. (14). Перевод гаплоидов в диплоидное состояние обычно осуществляется обработкой апикальных меристем водным раствором алкалоида колхицина (С22Н26О6). Удвоение числа хромосом в ядрах соматических клеток в дальнейшем приводит к образованию жизнеспособных гамет в отдельных секторах мужского и женского соцветий удвоенного гаплоида. Потомство, полученное в результате самоопыления фертильных растений, представляет собой поколение S1 новых автодиплоидных линий. Таким образом, гомозиготные линии можно получить за два полевых сезона, включая проведение скрещивания и выращивание гаплоидов.

Настоящая работа, целью которой было создание высокоэффективных индукторов матроклинных гаплоидов кукурузы, представляет собой продолжение исследований явления гаплоидии, начатых в 1967 году в Краснодарском НИИ сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко (КНИИСХ) по идее академика ВАСХНИЛ М.И. Хаджинова.

Методика. Работа выполнялась в 1984-2007 годах в КНИИСХ. На начальном этапе в качестве исходного материала для гибридизации использовали две группы метчиков, содержащих гены окраски A1C1R1-nj— шесть синтетических популяций-аналогов, созданных в КНИИСХ М.В. Чумаком (15) на основе известных образцов РЕМ и Stock 6, а также три линии зародышевых маркеров ЗМ 4, ЗМ 17, ЗМ 97 (6) селекции Саратовского государственного университета, родственных линии ЗМС 8. Исходным материалом для оценки гаплоиндуцирующей способности и отбора служили гибриды (РЕМ 48II x ЗМ 97)F2, [(8 RnjStock 6 x ЗМ 4) x ЗМ 97)]F1, (РЕМ 18 x ЗМ 17)F2, (5 RnjStock 6 x ЗМ 97)ВС1, [(РЕМ 48IV x 8 RnjStock 6) x ЗМ 97]ВС1, [(РЕМ 48II x 5 RnjStock 6) x ЗМ 97)]F2. Размножение семян индукторов в разных поколениях проводили самоопылением растений или переопылением между сестринскими растениями. Селекцию индукторов выполняли в соответствии с рабочей программой по массовому получению гаплоидов, поэтому на начальных этапах в качестве материнских форм использовали большое число источников. Гаплоиндуцирующую способность гибридных метчиков F1 оценивали по результатам скрещивания с различными тестерами — гибридами и популяциями, созданными с участием инбредных, а также автодиплоидных линий и рас кукурузы из Латинской Америки. Материнскими формами при оценке метчиков F2 были популяции кукурузы 4-го и 7-го циклов отбора, предоставленные в КНИИСХ д-ром R.J. Lambert (16): BS 3, BS 16, RDA, RSSS-С Pr. Для выявления гаплоиндуцирующей способности отдельных растений-метчиков применяли единый тестер — популяцию BS 10 c7 (далее BS 10) и в разные годы — несколько других популяций и гибридов обычной кукурузы с полузубовидным типом зерна. В скрещиваниях с материнскими тестерами пыльцой каждого метчика поколений F1 и F2С0 опыляли по 10-15 початков на каждой материнской форме, пыльцой индивидуальных растений поколений S0 и S1С0 — по 3-5 початков. Оценку семей поколений F6-F14 индукторов проводили, опыляя 4-10 и более початков тестера.

Использовали индивидуальный и семейный методы отбора с одновременной оценкой гаплоиндуцирующей способности отбираемых образцов. При отборе учитывали следующие фенотипические признаки: проявление антоциановой окраски зерновки и стебля, количество пыльцы на метелке. Для получения гаплоидов применяли метод индукции развития неоплодотворенной яйцеклетки в гаплоидный зародыш семени в условиях in vivo, для выявления гаплоидов — генетическое маркирование с участием генов A1C1R1-nj (в результате синтеза антоциана окрашены стебель, алейроновый слой эндосперма и зародыш зерновки). Пыльцой метчиков опыляли початки материнских форм желтозерной кукурузы, имеющей рецессивные признаки окраски (гены acr). Контролируемые скрещивания проводили ручным опылением растений согласно общепринятой методике с изолированием початков пергаментными пакетами. Предполагаемые гаплоиды — зерновки с неокрашенным (белым) зародышем и антоциановым алейроном эндосперма — отбирали в фазу сухих семян. Гибридные зерновки, у которых зародыш и эндосперм были окрашены, выбраковывали. Зерновки из группы предполагаемых гаплоидов проращивали в термостате, истинные гаплоиды выявляли по морфологическим признакам 3-суточных проростков (толщина зародышевого корешка, длина 1-го листочка). Частоту гаплоидов определяли как процентное отношение числа истинных гаплоидов к числу маркированных зерновок.

Результаты. Краснодарские метчики — аналоги РЕМ и Stock 6 характеризовались мощным габитусом растения, но апомиктичное развитие гаплоидных зародышей стимулировали в среднем с частотой 0,10 %, в то время как саратовские линии зародышевых маркеров ЗМ позволяли выделять гаплоиды с частотой до 1,00 % (А.Н. Завалишина, личное сообщение). На первом этапе селекции (С0 — нулевой цикл) гибридизация двух групп метчиков, различающихся двумя основными признаками, позволила получить рекомбинантные генотипы с полезными признаками обоих родителей (гибридный тип растения и повышенная способность к гаплоиндукции). Лучшая комбинация была отобрана по результатам тестирования гибридов F1 и F2 на гаплоиндуцирующую способность. Средняя частота индукции матроклинных гаплоидов у восьми изучаемых метчиков F1 (0,06 %) соответствовала среднему значению у родительских форм, у шести гибридов F2 (0,20 %) — находилась в пределах значений для линий ЗМ (табл. 1). Выполняя тест-скрещивания в поколениях F1 и F2 гибридных метчиков, для опыления собирали смесь пыльцы нескольких растений с делянки. При этом на некоторых маркированных початках материнских форм наблюдали отсутствие зерновок с немаркированным (гаплоидным) зародышем. Частота индукции у гибрида РЕМ 48II x ЗМ 97 в F1 и F2 (соответственно 0,14 и 0,27 %) достоверно превышала показатель у саратовских метчиков. При тестировании гибрида (РЕМ 48 II x ЗМ 97)F1 на разных материнских формах частота гаплоидов варьировала от 0,04 % (с популяцией инбредных линий) до 1,12 % (с автодиплоидными линиями); в варианте с популяцией BS 10 было обнаружено 0,11 % гаплоидов от числа маркированных зерновок.

В 1986 году при оценке гибридов F2 пять популяций-аналогов РЕМ и Stock 6 стимулировали возникновение гаплоидов в среднем с частотой 0,08 %, три линии ЗМ — с частотой 0,25 %. Частота индукции для шести гибридов F2С0 (нулевой цикл) составила в среднем 0,20 % (395 гаплоидов из 197 230 зерновок). Однако при тестировании на популяции RDA гибрид (РЕМ 48II x ЗМ 97)F2 показал наибольшую частоту гаплоиндукции — 0,94 % (53 гаплоида из 5670 зерновок). Мы выявили неодинаковое генотипическое влияние популяции RDA на индуцирующую способность родительских форм этого гибрида. Частота возникновения матроклинных гаплоидов в популяции RDA при опылении пыльцой метчика имела высокий для этого образца показатель 0,14 % (9 из 6460), а при опылении линией ЗМ 97 — 0,16 % (3 из 1890), то есть показатель, средний по величине. В то же время при скрещивании с тремя другими тестерами (BS 3, BS 16, RSSS-C Pr) метчик РЕМ 48II стимулировал возникновение гаплоидов с низкой частотой (0,04 %, или 7 из 17 770), а линия ЗМ 97 — с повышенной частотой (0,37 %, или 59 из 15 890). Сопоставление значений частоты гаплоиндукции, полученных при скрещивании с различными тестерами, указывает на разную генетическую и физиологическую природу взаимодействия генотипов РЕМ 48II и ЗМ 97 с генотипом одной и той же материнской формы.

1. Эффективность, этапы и методы отбора метчиков ЗМК 1 и ЗМК 1У на высокую частоту индукции матроклинных гаплоидов кукурузы

Год

Индуктор, исходный образец (P), поколение (F1-F14) и цикл (С03) отбора

Число изу-чаемых об-разцов, шт.

Частота гаплоиндукции в среднем (от-до), %

Система размножения, отбор по каждому
образцу

1984

Популяции — аналоги РЕМ и
Stock 6 P

4

0,04 (0,02-0,06)а

Размножение и тестирование смесью пыльцы

Линии ЗМ P

3

0,08 (0,05-0,13)а

1984

(Аналоги РЕМ и Stock 6 x ЗМ)F1C0

8

0,06 (0,03-0,14)а

Размножение и тестирование смесью пыльцы, выявление лучшего генотипа

(РЕМ 48II x ЗМ 97)F1C0

1

0,14

1986

(Аналоги РЕМ, Stock 6 x ЗМ)F2C0

6

0,20 (0,11-0,27)а

(РЕМ 48II x ЗМ 97)F2C0

1

0,27

(РЕМ 48II x ЗМ 97)F2C0-S0С1

2 (из 10)

0,87; 2,14

Самоопыление, тестирование пыльцы индивидуальных растений, отбор лучших растений

1987

(РЕМ 48II x ЗМ 97)F3C0-S1С1

10

4,01 (2,35-6,92)а

1988

(РЕМ 48II x ЗМ 97)F4C0-S2С1

4

6,22 (4,50-7,81)а

Семейное размножение, тестирование смесью пыльцы, отбор лучших семей

1989

ЗМК 1 F5C0-S3С1

1

Объединение семян четырех лучших семей, размножение смесью пыльцы

1993

ЗМК 1 F6C0-S4С1

1

7,53

Размножение и тестирование смесью пыльцы, отбор лучших початков

1994

ЗМК 1 F7C0-S1С2

2

8,00б

Семейное размножение, тестирование смесью пыльцы, отбор лучших початков

1995

ЗМК 1 F8C0-S2С2

7

5,64 (3,55-9,51)

1996

ЗМК 1У F9C0-S3С2

1

11,81

Объединение семян шести семей, размножение и тестирование смесью пыльцы

1997

ЗМК 1У F10C0-S4С2

2

12,24

Семейное размножение, тестирование смесью пыльцы, отбор лучших початков

1998

ЗМК 1У F11C0-S1С3

2

12,19

1999

 ЗМК 1У F12C0-S2С3

3

11,76

2001

 ЗМК 1У F13C0-S4С3

1

13,07

2002

 ЗМК 1У F14C0-S5С3

2

13,05

П р и м е ч а н и е. Прочерк означает, что показатель не определяли; а — интервал частоты индукции для отдельных образцов метчиков-гаплоиндукторов; б — из двух размноженных семей частоту гаплоидов определяли у одной.

Мы предположили, что растения метчика могут различаться по наличию и степени проявления генетического фактора индукции, поэтому на следующем этапе селекции провели самоопыление и индивидуальное тестирование пыльцы растений лучшего гибрида (РЕМ 48II x ЗМ 97)F2С0, предложенного в качестве исходного материала для дальнейшего отбора. При таком тестировании пыльцы ( то есть гаметофитного поколения S0С1) на популяции BS 10 для десяти растений гибрида F2С0 отмечали индукцию в среднем 0,41 % матроклинных гаплоидов. В том числе у двух растений (№№ 2 и 3) частота была высокой — соответственно 0,87 и 2,14 % (см. табл. 1), для пяти зарегистрированы средние показатели — от 0,15 до 0,40 %, тестирование еще трех выявило отсутствие гаплоидов в 15 маркированных початках. Варьирование частоты индукции от 0 до 2,14 % можно объяснить наличием или отсутствием фактора гаплоиндукции у растений в гибридной популяции (РЕМ 48II х ЗМ 97)F2С0 (вероятно, в результате спонтанной мутации, контролирующей микроспорогенез и/или микрогаметогенез). Высокая наследуемость признака гаплоиндукции, которая наблюдалась во всех последующих поколениях гибридной комбинации РЕМ 48II x ЗМ 97 — от F2 до F14, положительно повлияла на эффективность отбора (см. табл. 1).  

В отличие от популяции РЕМ 48II у линий ЗМ, а также у метчика (РЕМ 48II х ЗМ 97) во всех поколениях, начиная с F3, при опылении смесью пыльцы зерновой набор початков характеризовался череззерницей, наличием не имеющих зародыша и щуплых зерновок. Для сохранения оптимальной озерненности вместо самоопыления (поколения F2 и F3) образцы метчиков в F4-F14 размножали посемейно, то есть смесью пыльцы с делянки, и в отдельных случаях — сочетанием обоих способов. Череззерницу и дефектные зерна наблюдали и на початках материнских форм, опыленных пыльцой индукторов, то есть в маркирующих скрещиваниях. При размножении «в себе» у популяций и гибридов обычной кукурузы отклонений в развитии зерна не отмечали.

Средняя частота гаплоиндукции 10 потомков растений № 2 и № 3 в поколении S1С1 составляла 4,01 %. Четыре линии поколения S2С1, индуцирующие гаплоиды с частотой 4,50-7,81 %, стали основой для создания гаплоиндуктора ЗМК 1 (зародышевый маркер краснодарский). Частота возникновения матроклинных гаплоидов в популяции зубовидной кукурузы П3, опыленной пыльцой индуктора ЗМК 1 (S4C1), составила 7,53 % (140 гаплоидов из 1860 маркированных зерновок). То есть в результате первого цикла отбора на увеличение гаплоиндуцирующей способности, проведенного в трех поколениях (F2-F4) гибрида РЕМ 48II x ЗМ 97, частота индукции гаплоидов увеличилась в 28 раз по сравнению с таковой у исходной формы (F2C0 — 0,27 %). Популяция ЗМК 1 отвечает требованиям, предъявляемым к опылителям: высота растений достигает 150-170 см, ветвящаяся метелка обладает хорошей пыльцеобразующей способностью. Гомозиготное состояние маркирующей системы генов A1C1R1-nj гаплоиндуктора ЗМК 1 обеспечивало четкое окрашивание зерна самого индуктора и гибридных зерновок на маркированных початках материнских форм зубовидного и полукремнистого типа. Однако у некоторых линий кремнистого типа и зубовидной линии Т 22 антоциановая окраска эндосперма и зародыша не проявилась из-за наличия у этих форм генов-модификаторов или генов-ингибиторов.

Одновременно с использованием ЗМК 1 для массового получения гаплоидов мы продолжали проводить отбор семей на повышенную частоту гаплоиндукции. Второй цикл отбора выполняли в четырех (с F7C0-S1С2 по F10C0-S4С2) семенных поколениях индуктора ЗМК 1 (см. табл. 1). Причем наряду с основным признаком (число зерновок с гаплоидным зародышем, выявленных на маркированных початках материнского тестера) учитывали косвенный признак гаплоиндукции — наличие беззародышевых и щуплых зерновок, а также эффект череззерницы на початках индуктора, что свидетельствует о нарушениях в мужской генеративной сфере, обусловливающих одинарное оплодотворения или его полное отсутствие. Частота индукции гаплоидов семи семей F8C0-S2С2 варьировала от 3,55 до 9,51 %. Подсчет числа беззародышевых зерен на початках индукторов показал, что для семьи с минимальным числом беззародышевых зерен (2,13 %, или 13 дефектных из 623 обследованных) характерна наименьшая частота (3,55 %) индукции гаплоидов. В семье с наибольшей (9,51 %) частотой индукции матроклинных гаплоидов на початках индуктора выявили и максимальную долю беззародышевых зерен (11,4 %, или 31 из 302).

В 1996 году была создана новая популяция — гаплоиндуктор ЗМК 1У (17). С этой целью высевали смесь взятых в равном количестве семян шести семей индуктора ЗМК 1 (F8C0-S2С2) c частотой гаплоиндукци от 3,55 до 9,51 % и выращенные растения опыляли смесью взятой с них пыльцы для получения семян F9C0-S3С2. На материнской форме BS 10 пыльца, собранная с растений индуктора ЗМК 1У, стимулировала возникновение 11,81 % матроклинных гаплоидов (157 из 1330 маркированных зерновок). Третий цикл отбора в четырех поколениях (F11C0-S1С31—F14C0-S4С3) был направлен на стабилизацию высокой гаплоиндукцирующей способности у популяции ЗМК 1У. Семена различных семей получали как самоопылением, так и опылением смесью пыльцы, контролируя число доброкачественных зерен в початке. По результатам тестирования пыльцы внутрисемейный отбор початков индуктора на частоту индукции гаплоидов и беззародышевых зерен дал положительный эффект: в этих четырех поколениях индуктор ЗМК 1У стабильно стимулировал возникновение гаплоидов с высокой частотой — от 11,76 до 13,07 % (см. табл. 1).

Полученные положительные результаты (увеличение частоты индукции гаплоидов во втором и стабилизация — в третьем цикле селекции индукторов) позволяют сделать заключение о правильности выбора дополнительного признака отбора — доли зерен без зародыша в початках индуктора. Однако анализ наших многолетних наблюдений не позволяет утверждать, что между двумя этими признаками (частота индукции матроклинных гаплоидов и частота появления зерен без зародыша в початках индуктора) имеется прямая связь. В то же время факт наличия зерен с неразвитым зародышем и в разной степени выраженную череззерницу необходимо учитывать, планируя получение необходимого количества семян индукторов. В испытаниях 2002 года в одном початке у индуктора завязывалось в среднем небольшое число зерен с развитым зародышем: у ЗМК 1, ЗМК 1У и ЗМК 3 — соответственно 83, 85 и 41 зерно. Линия ЗМК 3 — инбредный потомок гибрида (РЕМ 48II x ЗМ 97)F2-S2С0, который характеризовался лучшим показателем частоты индукции гаплоидов (7,81 %). В поколениях F9-F12 частота гаплоиндукции у этой линии варьировала от 10,00 до 14,00 % в зависимости от условий года и генотипа источника гаплоидов.

2. Частота и число гаплоидных зерновок при различных условиях опыления гибридов кукурузы пыльцой гаплоиндукторов ЗМК

Скрещивание

Год

Число, шт.

Частота гаплоидов, %

материнских форм

маркированных
початков

гаплоидов

в среднем

от-до

Контро-
лируемое (селекционный питомник)

2007

8

270

2864

9,90

7,30-14,00

Неконтро-
лируемое (изолированный участок)

2004

22

1557

11768

4,40

1,70-6,80

Использование гаплоиндукторов ЗМК дает возможность массового получения гаплоидов как при ручном скрещивании с изолированием початков пергаментными пакетами (контролируемое опыление), так и при свободном опылении початков на пространственно изолированном участке с обрыванием метелок на растениях материнских форм (табл. 2).

Значительное варьирование частоты гаплоидов как в опыте, так и по годам объясняется генетическим влиянием материнского и отцовского родителей, поскольку источниками гаплоидов служили разные гибриды кукурузы, а в качестве опылителей использовались различные образцы из рабочей коллекции гаплоиндукторов ЗМК. На частоту возникновения гаплоидов, кроме генетических факторов, вероятно, влияют неконтролируемые модифицирующие факторы внешней среды. Увеличение площади посева и использование эффективных гаплоиндукторов при наличии технического персонала позволит получать гаплоидные зерновки в необходимом количестве.

Результаты наших исследований подтверждают известные утверждения многих авторов о генетической детерминации явления гаплоидии у кукурузы. Источником гаплоиндуцирующей способности у ЗМК мог служить генетический материал линии Stock 6, присутствующий в генотипе обоих родителей маркера РЕМ 48II x ЗМ 97. F.К. Rober в 1999 году (18), используя метод полиморфизма длин рестриктных ферментов (RLFP), получил результаты, указывающие на вероятность существования у индуктора ЗМК 1 мутации, отличающей его от Stock 6. У индуктора KEMS (KEMS — Krasnodar empryo marker syntetic) только 21,10 % RLFP-маркеров были одинаковыми со Stock 6, 78,89 % — различались и указывали на наличие аллеля Х неизвестного родителя или гетерозиготы. Надо отметить, что в разные годы частота индукции у лучшего по этому признаку родителя ЗМК 1 — линии ЗМ 97 не превышала верхний предел варьирования показателя у ЗМС (2,23 %) (6) и у Stock 6 (3,23 %) (10). Низкая гаплоиндуцирующая способность (< 1 %) второго исходного метчика РЕМ 48II свидетельствует о небольшой доле влияния генотипа Stock 6 на этот образец.

Повышение частоты гаплоиндукции почти в 100 раз — с 0,14 % у гибрида (РЕМ 48II x ЗМ 97)F1С0 до 13,05 % у популяции ЗМК 1У (F14C0-F4С3) можно объяснить действием новой мутации. Фенотипическое проявление признаков, свидетельствующих о нарушении в системе оплодотворения у индукторов ЗМК (череззерница, наличие не имеющих зародыша и щуплых зерновок в початках), дает основание полагать, что, как и в опытах Н.Х. Еналеевой с соавт. (13) и С.Т. Чалыка (2), действие мутации связано с дефектами развития мужских гамет. Увеличение частоты гаплоиндукции можно объяснить еще несколькими причинами. Так, учитывая, что для кукурузы характерен перекрестный тип опыления, а метчик РЕМ 48II представляет собой популяцию, можно предположить, что рекомбинантные генотипы, несущие эту мутацию, сформировались уже в F1. В F2 могли возникнуть новые комбинации генов. Эти генотипы были зафиксированы двукратным самоопылением в поколениях S0 и S1 и отобраны по результатам тестирования пыльцы индивидуальных растений. Смена способов опыления (переопыление между разными растениями и самоопыление), используемых для получения семенного потомства индукторов, могла стать причиной увеличения частоты мутантного аллеля или аллелей и аллельных взаимодействий, то есть изменения генетической и генотипической структуры исходной популяции (РЕМ 48II x ЗМ 97)F2, наконец, длительное давление отбора в 13 поколениях (F2-F14) гибрида, вероятно, способствовало увеличению частоты мутантного аллеля.

S. Deimling с соавт. (8) в Германии использовали высокий потенциал гаплоиндукции метчика ЗМК 1 для создания нового гаплоиндуктора RWS. По их данным, частота индукции гаплоидов (6,92 %) у КЕМS (ЗМК 1) превышала таковую (1,99 %) у французской линии WS 14 более чем в 3 раза. Гаплоиндукторы кукурузы ЗМК 1, ЗМК 1У и ЗМК 3 применяются в российской и мировой селекционной практике для массового получения гаплоидов и ускоренного создания гомозиготных линий кукурузы. Введение в ЗМК маркерного гена негативного отбора pehA, отвечающего за синтез фермента монофосфатэстеразы, позволило американским исследователям (19) эффективно выявлять гаплоиды в культуре незрелых зародышей.

Итак, в результате трех циклов отбора на признак высокой частоты гаплоиндукции созданы новые индукторы ЗМК — линии и популяции, стимулирующие возникновение гаплоидов кукурузы с частотой 6-13 % и более. Использование гаплоиндукторов ЗМК делает возможным массовое получение гаплоидов и внедрение в селекционную практику ускоренного метода создания гомозиготных линий кукурузы.

Работа выполнена под руководством к.б.н. В.С. Щербака. Автор выражает благодарность сотрудникам Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского профессору, д.б.н. В.С. Тырнову и к.б.н. А.Н. Завалишиной, любезно предо-ставившим исходные образцы линий ЗМ, а также бывшим сотрудникам КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко к.с-х.н. Э.Р. Забировой и к.б.н. М.В. Чумаку за содействие и помощь в проведении экспериментов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. З а б и р о в а  Э.Р.,  Ч у м а к  М.В.,  Ш а ц к а я  О.А.,  Щ е р б а к  В.С. Технология массового ускоренного получения гомозиготных линий. Кукуруза и сорго, 1996, 4: 17-19.
2. Ч а л ы к  С.Т. Методы гаплоидии в генетике и селекции кукурузы. Кишинев, 2003.
3. R o b e r  F.K.,  G o r d i l l o  G.A.,  G e i g e r  H.H. In vivo induction in maise — performance of new inducers and significance of doubled lines in tybrid breeding. Maydica, 2005, 50: 275-283.
4. http://www.pioneer.com/CMRoot/
pioneer%5Cresearch%5Cpipeline%5Cspec_sheets%5CDoubledHaploids. 06.02.2009.
5. http://www.greatlakeshybrids.com/performance/research-information/doubled-haploid-breeding-tech-nology/ 30.05.2008.
6. Т ы р н о в  В.С.,  З а в а л и ш и н а  А.Н. Индукция высокой частоты возникновения матроклинных гаплоидов у кукурузы. ДАН СССР, 1984, 276(3): 735-738.
7. L a s h e r m e s  P.,  B e c k e r t  M. Genetic control of maternal haploidy maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines. Theor. Appl. Genet., 1988, 76: 570-572.
8. D e i m l i n g  S.,  R o b e r  F.K.,  G e i g e r  H.H. Methodik und Genetic der in-vivo-Haploideninduction bei Mais. Vortr. Pflanzenzuchtung, Stuttgart, Germany, 1997, 38: 203-224.
9. C h a s e  S.S. Monoploid frequencies in a commercial doubl cross hybrid maize and in its component single cross hybrids and inbred lines. Genetics, 1949, 34: 328-332.
10. C o e  E.H. A line of maize with high hafoid frequency. Amer. Nat., 1959, 93: 381-382.
11. S a r k a r  K.R. Genetic selection techniques for the production of hahloids in plants. Proc. 1st Int. Symp. «Haploids in higher plants. Advances and potential». Guelph, Canada, 1974: 33-42.
12. Ч у м а к  М.В. Получение и выделение матроклинных и андрогенных гаплоидов кукурузы. Канд. дис. Л., 1977.
13. Е н а л е е в а  Н.Х.,  Т ы р н о в  В.С.,  С е л и в а н о в а  Л.П.,  З а в а л и ш и н а  А.Н. Одинарное оплодотворение и проблема гаплоидии у кукурузы. ДАН СССР, 1997, 353(3): 405-407.
14. N a n d a  D.K.,  C h a s e  S.S. An embryo marker for detecting monoploids of maize (Zea mays L.). Crop. Sci., 1966, 6: 213-215.
15. Х а д ж и н о в  М.И.,  Ч у м а к  М.В. Создание новых маркеров для выделения гаплоидов кукурузы. В сб.: Апомиксис и цитоэмбриология растений. Вып. 4. Саратов, 1978: 117-118.
16. L a m b e r t  R.J. Breeding maize in a non-limiting environment. Proc. IX Meeting of Eucarpia maize and sorgum section. Krasnodar, 1977, 156-174.
17. Патент ¹ 1057 на селекционное достижение сорт кукурузы ЗМК 1У от 11.09.2001 с датой приоритета 10.10.2000. Государственный реестр охраняемых селекционных достижений Российской Федерации. М., 2002.
18. R o b e r  F.K. Fortpflanzungsbiologische und genetische Untersuchungen mit RLFP-Markern zur in vivo-Haploideninduktion bei Mais. Verlag Grauer. Stutgart, Germany, 1999.
19. S i d o r o v  V.,  B r a r  G.,  F o l e y  T. e.a. Transformation of haploid corn and the production of dihaploid transgenic plants. XIV Int. Conf. «Plant & animal genomes». San Diego, CA, 2006, post. 690.

 

 

HAPLOINDUCTORS ISOLATION IN MAIZE: THREE CYCLES OF SELECTION ON HIGH FREQUENCY OF INDUCTION OF MATROCLINAL HAPLOIDS

O.A. Shatskaya

With a using of hybridization of initial markers, revelation of individual plants with high frequency of induction and three cycles of selection during 14 generation of hybrid sample (РЕМ 48II x ЗМ 97)F1 the authors isolated maize haploinductors of ЗМК 1, ЗМК 1У and ЗМК 3 with high frequency of haploid induction — 5-7, 8-15 and 10-14 %, respectively. High effective haploinductors of ЗМК give an extended facility for using of haploidization method in breeding programs on isolation of maize homozygous lines.

Key words: Zea mays L., embryo marker, maternal haploids, haploid induction rate, inducers, selection.

ГНУ Всероссийский НИИ риса Россельхозакадемии,
350921 г. Краснодар, п/о Белозерное,
e-mail: serggontchar@mail.ru

Поступила в редакцию
14 декабря 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало