УДК 633.853.494:633.52:631.461.5:[577.2.08+57.086.83

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАПСА (Brassica napus L.) СОРТА HANNA С ПОМОЩЬЮ Agrobacterium tumefaciens AGL0

А.В. КНЯЗЕВ, З.Р. ВЕРШИНИНА, А.Х. БАЙМИЕВ, А.В. ЧЕМЕРИС

Исследовали влияние гормонального состава сред и концентрации антибиотика гигромицина на регенерацию побегов из семядольных эксплантов рапса (Brassica napus L.) сорта Hanna. Для получения трансгенных растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0 с плазмидой pCAMBIA 1305.1, содержащей гены лектина гороха (psl), β-глюкуронидазы (gus) и гигромицинфосфотрансферазы (hptII) в области Т-ДНК. Достигнута эффективность трансформации 1,8 % при использовании гигромицина в качестве селективного антибиотика. ПЦР-анализ ДНК из трансгенных растений подтвердил наличие и экспрессию перенесенного гена psl на уровне мРНК.

Ключевые слова: Brassica napus, трансгенные растения, регенерация, ген hpt.

 

Рапс (Brassica napus L.) входит в число наиболее ценных и перспективных сельскохозяйственных культур. Программы по созданию его новых сортов приняты во многих странах. Уже получены растения, устойчивые к грибным и вирусным заболеваниям, абиотическим факторам, гербицидам, а также линии с улучшенными кормовыми качествами семян, измененным составом масла и т.д. (1, 2).

Чужеродные гены в растения рапса можно вводить прямыми методами, однако большинство работ посвящены трансформации с помощью Agrobacterium. Эффективность подобной трансформации зависит от сортовых особенностей и возраста растения — донора эксплантов, гормонального состава сред, типа используемого экспланта и выбора системы селекции. Хотя методы агробактериальной трансформации разработаны для большинства видов сельскохозяйственных культур, они применимы в пределах каждого вида только к немногим генотипам (сортам), которые регенерируют in vitro с высокой частотой. Поскольку регенерация у B. napus в культуре in vitro высоковариабельна и генотипоспецифична (3, 4), универсальной методики агробактериальной трансформации рапса не существует и разработка приемов регенерации остается актуальной.

Большинство экспериментов по трансформации рапса выполнены с яровым сортом канадской селекции B. napus L. ssp. oleifera cv. Westar (5-7), который в настоящее время в производстве не используется. Эти методики относительно специфичны для Westar, и их сложно адаптировать к работе с другими яровыми сортами. Кроме того, в подавляющей части исследований в качестве растительного селективного маркера использовали ген устойчивости к канамицину npt, хотя ген устойчивости к гигромицину hpt более предпочтителен, так как растительные ткани намного чувствительнее к этому антибиотику. Практически не встречается данных об эффективном получении трансгенных растений рапса, где в качестве селективного служит ген устойчивости к гигромицину — либо эффективность очень мала (8), либо она нулевая (9).

Сорт шведской селекции Hanna относится к безэруковым, устойчив к полеганию и осыпанию, поэтому широко культивируется во всем мире (10, c. 148). Имеется несколько сообщений об агробактериальной трансформации растений этого сорта, но все описанные методики с использованием канамицина в качестве селективного маркера неэффективны либо малоэффективны (4, 11, 12). Известно также, что штамм Agrobacteriumtum efaciens AGL0 обладает повышенной вирулентностью (13).

Целью настоящей работы был подбор оптимального гормонального состава сред для регенерации побегов из семядольных эксплантантов рапса сорта Hanna, а также оценка влияния антибиотика гигромицина на регенерацию и трансформациию растений с помощью супервирулентного штамма Agrobacteriumtum efaciens AGL0.  

Методика. Объектом исследований стал яровой сорт рапса Hanna с периодом вегетации 76-86 сут.

Семена для всех экспериментов поверхностно стерилизовали в течение 1 мин в 70 % спирте, затем 20 мин в 1 % растворе гипохлорита натрия с добавлением нескольких капель Твин 20, 5-кратно промывали стерильной водой и проращивали на среде, содержащей половину дозы солей среды Мурасиге-Скуга (МС) (14), 10 % сахарозы, 8 г/л агарозы («Helicon», Россия) (рН 5,7), в течение 1 сут при 8 °С в темноте и 4-5 сут при температуре 25 °С и 16-часовом световом дне в климатической камере KBW 240 («Binder», Германия).

При подборе оптимального гормонального состава сред для регенерации побегов вырезанные семядоли с черешками помещали на среду МС с добавлением витаминов группы В5 (15), инозитола (100 мг/л), сахарозы (2 %), поливинилпирролидона (PVP 25) (0,5 г/л), Mes в качестве буфера (0,5 г/л), гибберелловой кислоты (0,01 мг/л), гидролизата казеина (200 мг/л), AgNO3 (5 мг/л) и агарозы (8 г/л). В среду вносили фитогормоны в различных комбинациях и концентрациях. В качестве ауксина использовали нафтилуксусную кислоту (НУК), в качестве цитокининов — 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатинрибозид (ЗР) и тидиазурон (ТДЗ); pH всех сред до стерилизации — 5,7. Среды стерилизовали автоклавированием при 121 °С в течение 20 мин. При высаживании эксплантов в среду помещали только кончик семядольного черешка (семядоля среды не касалась). В каждой комбинации гормонов использовали по 18-20 эксплантов. Влияние различного гормонального состава сред на регенерацию побегов оценивали по доле эксплантантов, регенерировавших побеги после 4 нед культивирования, от общего числа эксплантов.

При трансформации растенийиспользовали бинарный вектор pCAMBIA1305.1, любезно предоставленный фирмой «Cambia» (Австралия) (http://www.cambia.org.au). Вектор, способный реплицироваться в клетках Escherichiacoli и Agrobacterium sp., содержит в области Т-ДНК репортерный ген gus с каталазным интроном, ответственный за расщепление β-D-глюк-уронидов, и селективный ген hptII гигромицинфосфотрансферазы, придающей устойчивость к гигромицину. В качестве маркера для ПЦР в Т-ДНК вектора был встроен ген лектина гороха посевного psl под контролем 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (16). Генетическую конструкцию переносили в штамм A. tumefaciens AGL0 методом электропорации.

В опытах по трансформации использовали свежую ночную культуру A. tumefaciens, выращенную при 28 °С на шейкере (150 об/мин) в минимальной среде Min A (17) с добавлением рифампицина (100 мг/л) и канамицина (50 мг/л). Перед инокуляцией культуру агробактерий центрифугировали (3500 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в жидкой среде Min A. Суспензию агробактерий разводили до титра 108 КОЭ/мл, контролируя ее плотность на спектрофотометре СФ-46 («ЛОМО», Россия).

Для проверки чувствительности неинокулированных A. tumefaciensсемядольных эксплантантов к антибиотику гигромицину использовали среду, содержащую ТДЗ (0,3 мг/л) и НУК (0,03 мг/л). Образцы помещали на чашки Петри с регенерационной средой, содержащей гигромицин (0; 2; 4; 6; 8 и 10 мг/л). Через 4 нед культивирования их исследовали на инициирование каллуса и регенерацию адвентивных побегов. Частоту адвентивного органогенеза оценивали как отношение (%) числа эксплантов с регенерированными побегами к общему числу эксплантов в опыте.

В качестве эксплантов в экспериментах по трансформации использовали семядоли 4-5-суточных сеянцев с черешком в основании и без апикальной меристемы (18). Отделенные семядоли кончиком черешка обмакивали в суспензию A. tumefaciens (5-10 с) и тем же кончиком помещали на регенерационную среду. Регенерационная среда содержала соли по МС, витамины группы В5, инозитол (100 мг/л); ТДЗ (0,3 мг/л); НУК (0,03 мг/л); гиббереловую кислоту (0,01 мг/л); PVP 25 (0,5 г/л); Mes (0,5 г/л); гидролизат казеина (200 мг/л); сахарозу (20 г/л) и агарозу (8 г/л). Через 2 сут культивирования экспланты переносили на свежую среду того же состава с добавлением AgNO3 (5 мг/л), карбенициллина (500 мг/л) и без селективного антибиотика. Раствор нитрата серебра стерилизовали фильтрованием и добавляли к автоклавированной и охлажденной до 40 °С среде. Через 20 сут культивирования экспланты переносили на селективную среду, которая имела тот же состав, но с добавлением гигромицина (5 мг/л). На протяжении всего периода селекции концентрацию гигромицина в селективной среде постепенно повышали до 15 мг/л, пересаживая экспланты на свежую селективную среду каждые 10-14 сут. Появляющиеся на кончике семядольного черешка зеленые каллусы отделяли и переносили на свежую селективную среду. Дифференцирующиеся зеленые побеги отрезали и помещали на среду без гигромицина, содержащую половину дозы солей МС, витамины группы В5, сахарозу (1 %), агарозу (8 г/л), 6-БАП (0,05 мг/л) и антибиотик карбенициллин (Cb) (500 мг/л) для укоренения.

Укорененные побеги высаживали в грунт и адаптировали к условиям светоплощадки. Частоту трансформации определяли как отношение (%) числа полученных на селективной среде трансгенных побегов к общему числу высаженных эксплантов.

Гистохимический анализ экспрессии гена gus (по активности β-глюкуронидазы) проводили по описанной методике (19) с небольшими модификациями (20). Части отрезанных листочков предположительно трансгенных побегов инкубировали в реактиве X-gluc, содержащем 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (1 мг/мл), Тритон X-100 (0,5 %), Na2-ЭДТА (100 мМ), метанол (20 %), K3Fe(CN)6 (0,5 мМ), K4Fe(CN)6 (0,5 мМ) и натриевый фосфатный буфер (50 мМ) (pH 7,0). Ткани инкубировали при 37 °С в течение ночи, отмывали от хлорофилла в 70 % этиловом спирте, выдерживали в 50 % растворе глицерина в воде и микроскопировали (стереомикроскоп МБС-10, Россия).

Для ПЦР-анализаДНК трансгенных растений выделяли фенольно-детергентным методом, тотальную РНК (с проведением ревертазной реакции) — с использованием наборов TRizol Reagents («Invitrogen», США) и GenePak RT Core НПФ («Галарт-Диагностикум», Россия). Наличие гена лектина psl в препаратах ДНК и кДНК выявляли с помощью ПЦР с использованием фланкирующих его праймеров (16) и стандартных наборов для реакционной смеси в амплификаторе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия) при оптимальной для каждой пары праймеров температуре отжига.

Для данных, обработанных статистически, представлены средние значения и стандартные ошибки.

Результаты. Регенерацию целых растений in vitro часто рассматривают как генетическое свойство сорта, но значительную роль при этом играет гормональный состав среды. Наши эксперименты показали, что среда для регенерации побегов из семядольных эксплантов рапса сорта Westar, предложенная M.M. Moloney с соавт. (18) и содержащая высокие концентрации 6-БАП (4-5 мг/л), для рапса сорта Hanna не оптимальна. Регенерационную реакцию отмечали не более чем у 10 % эксплантов. Поэтому при оптимизации гормонального состава, кроме 6-БАП, использовали более сильные цитокинины — ЗР и ТДЗ (21).

В варианте с ТДЗ вместо 6-БАП эффект был значительно выше (доля органогенных эксплантов достигала 75-90 % в зависимости от концентрации). Сходный результат получили на среде, содержащей одновременно 6-БАП и ЗР (77,8 %) (табл.).

Частота регенерации побегов из эксплантов семядолей рапса (Brassica napus L.) сорта Hanna в зависимости от концентрации фитогормонов в среде Мурасиге-Скуга (МС)

Концентрация фитогормонов, мг/л

Доля органогенных
эксплантов, % (Х±х)

6-бензилами-
нопурин

зеатинрибозид

тидиазурон

нафтилуксусная
кислота

4,0

10,3±5,2

4,5

0

4,5

1,0

0,1

0,01

0

2,0

77,8±5,5

1,0

0,05

81,3±1,1

0,5

0,05

75,6±4,4

0,5

0,05

75,9±0,9

0,3

0,03

73,3±3,3

0,3

0,03

90,5±9,5

0,3

0,01

66,7±4,7

0,1

0,005

73,8±11,9

П р и м е ч а н и е. Прочерк означает, что соответствующие фитогормоны в среду не добавлялись.

Рис. 1. Регенерация побегов из каллуса, полученного в результате трансформации семядольных эксплантов рапса (Brassicanapus L.) сорта Hanna с помощью штамма Agrobacteriumtumefaciens AGL0, на среде без гигромицина.

Частота регенерации побегов на 35-е сут культивирования при концентрации гигромицина в регенерационной среде 0; 2; 4; 6; 8 и 10 мг/л составила соответственно 70,8±4,2; 25,0±7,2; 7,8±3,9; 0; 0 и 0 %. То есть у интактных семядольных эксплантов уже при концентрации гигромицина в среде 2-4 мг/л сильно угнеталось побегообразование, а концентрация выше 5 мг/л полностью его подавляла, что согласуется с данными других авторов (8, 9). Таким образом, в опытах по трансформации начальной была выбрана концентрация гигромицина 5 мг/л, которую при дальнейшей селекции повышали до 15 мг/л.

Первые регенерированные побеги появились приблизительно через 2,5 мес после трансформации (рис. 1), еще 1 мес понадобился для роста и укоренения. Трансгенность полученных растений была подтверждена в ПЦР (обнаружение и доказательство экспрессии гена лектина psl на уровне мРНК), а также гистохимическим анализом активности gus-гена в тканях листа.Полученные растения-регенеранты обладали высокой активностью β-глюкуронидазы (после инкубации сегментов листьев с гистохимическим реактивом появлялось характерное синее

Рис. 2. Цветная реакция на активность β-глюкуронидазы (gus) у этиолированных листьев растений-реге-нерантов рапса (Brassicanapus L.) сорта Hanna. Темные участки соответствуют характерному синему окрашиванию после инкубации в гистохимическом реактиве.

окрашивание, наиболее интенсивное в мезофильных клетках листа, а также в его проводящих тканях) (рис. 2).

Эффективность разработанного нами метода трансформации рапса сорта Han-na составляет около 1,8 %, что гораздо выше, чем у некоторых авторов, в частности 0,3 % при селекции на канамицине (11), и сравнимо с эффективностью, достигнутой в другой работе (12) — 4,4 % (также на канамицине). Однако в последнем случае был использован слабовирулентный штамм A. tumefaciensGV3101, что значительно усложняло проведение трансформации. Кроме того, мы применили селекцию на гигромицине, который намного токсичнее канамицина для растительных тканей и, следовательно, обеспечивает более надежную селекцию.

Итак, разработана методика агробактериальной трансформации рапса сорта Han-naс применением антибиотика гигромицина в качестве селективного маркера.Полученные результаты могут быть использованы для создания трансгенных растений этого сорта с различными хозяйственно полезными признаками.

 

 

 

 

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Ж и д к о в а  Е.Н.,  К а р п а ч е в  В.В. Получение ресинтезированных форм ярового рапса с целью селекции на желтосемянность и жирнокислотность масла. С.-х. биол., 1996, 5: 123-125.
2. Р а д ч у к  В.В.,  Б л ю м  Я.Б. Успехи и проблемы генетической трансформации растений семейства крестоцветных. Цитология и генетика, 2005, 3: 13-29.
3. P h o g a t  S.K.,  B u r m a  P.K.,  P e n t a l  D. High frequency regeneration of Brassica napus varieties and genetic transformation of stocks containing fertility restorer genes for two cytoplasmic male sterility systems. J. Plant Biochem. Biotechnol., 2000, 9: 73-79.
4. Р а л д у г и н а  Г.Н.,  Г о р е л о в а  С.В.,  К о ж е м я к и н  А.В. Стабильность и наследование трансгенов в растениях рапса. Физиол. раст., 2000, 47(3): 437-445.
5. B o u l t e r  M.E.,  C r o y  E.,  S i m p s o n  P.,  S h i e l d s  R.,  C r o y  P.R.D.,  S h i r-
s a t  A.H. Transformation of Brassica napus L. (Oilseed Rape) using Agrobacterium tumefaciense and Agrobacterium rhizogenes: a сomparison. Plant Sci., 1990, 70: 91-99.
6. P o n s t e i n  A.S.,  B a d e l  J.B.,  V e r w o e r d  T.C.,  M o l e n d i j k  L.,  S t o r m s  J.,  B e u d e k e r  R.F.,P e n  J. Stable expression of phytase (phyA) in canola (Brassica napus) seeds: towards a commercial product.Mol. Breed., 2002, 10: 31-44.
7. C a r d o z a  V.,  S t e w a r t  C.N. Increased Agrobacterium-mediated transformation and rooting efficiencies in canola (Brassica napus L.) from hypocotyl segment explants. Plant Cell Rep., 2003, 21: 599­604.
8. S t o u t j e s d i j k  P.A.,  H u r l s t o n e  C.,  S i n g h  S.P.,  G r e e n  A.G. High-oleic Australian Brassica napus and B. juncea varieties produced by co-suppression of endogenous D12-desaturases. Biochem. Soc. Trans., 2000, 28: 938-940.
9. K h a n  M.R.,  R a s h i d  H.,  A n s a r  M.,  C h a u d r y  Z. High frequency shoot regeneration and Agrobacterium-mediated DNA transfer in canola (Brassica napus). Plant Cell Tissue Organ Cult., 2003, 75: 223-231.
10. Ф е д о т о в  В.А.,  Г о н ч а р о в  С.В.,  С а в е н к о в  В.П.Рапс России. М., 2008.
11. S c h r o d e r  M.,  D i x e l i u s  C.,  R a h l e n  L.,  G l i m e l i u s  K. Transformation of Brassica napus by using the aadA gene as selectable marker and inheritance studies of the marker genes. Physiol. Plant., 1994, 92: 37-46.
12. Р а д ч у к  В.В.,  К л о к е  Э.,  Р а д ч у к  Р.И.,  Н о й м а н н  М.,  Б л ю м  Я.Б.  Получение трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) c помощью Agrobacterium tumefaciens.Генетика, 2000, 36(7): 932-941.
13. L a z o  G.R.,  S t e i n  P.A.,  L u d w i g  R.A. A DNA transformation-competent arabidopsis genomic library in agrobacterium. BioTechnology, 1991, 9: 963-967.
14. M u r a s h i g e  T.,  S k o o g  F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 1962, 15: 473-497.
15. G a m b o r g  O.L.,  M i l l e r  R.A.,  O j i m a  K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 1968, 50: 51-158.
16. G a t e h o u s e  J.A.,  B o w n  D.,  E v a n s  I.M.,  G a t e h o u s e  L.N.,  J o b e s  D.,  P r e s t o n  P.,  C r o y  R.R.D. Sequence of the seed lectin from pea (Pisum sativum L.). Nucl. Acids Res., 1987, 15: 7642.
17. M i l l e r  J.H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor, 1972.
18. M o l o n e y  M.M.,  W a l k e r  J.M.,  S h a r m a  K.K. High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Rep., 1989, 8: 238-242.
19. J e f f e r s o n  R.A. Assaying сhimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep., 1987, 5: 387-405.
20. K o s u g i  S.,  O h a s h f  Y.,  N a k a j i m a  K.,  A r a i  Y. An improved assay for β-glucuronidase in transformed cells: methanol almost completely suppresses a putative endogenous β-glucuronidase activity. Plant Sci., 1990, 70: 133-140.
21. H u e t t e m a n  C.A.,  P r e e c e  J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture. Plant Cell Tissue Organ Cult., 1993, 33: 105-119.

 

GENETIC TRANSFORMATION OF Brassica napus L. HANNA VARIETY WITH THE HELP OF Agrobacterium tumefaciens AGLO

A.V. Knyazev, Z.R. Vershinina, A.Kh. Baimiev, A.V. Chemeris

The authors investigated the effect of hormonal composition of media and concentration of hygromicin antibiotic on regeneration of sprouts from cotyledonous explants of Brassica napus L. Hanna variety. For isolation of transgenic plants the authors use the strain of Agrobacterium tumefaciens AGL0 with plasmid pCAMBIA 1305.1, containing the lectin genes of pea (psl), β-glucuro-nidase (gus) and hygromicin phosphotransferase (hptII) in the T-DNA. During using of hygromicin as selective marker, the efficiency of transformation reaches to 1,8 %. PCR-analysis of DNA from transgenic plants confirms the presence and the expression of translocated gene of psl on mRNA level.

Key words: Brassica napus, transgenic plants, regeneration, hpt gene.

Институт биохимии и генетики
Уфимского научного центра РАН,

450054 г. Уфа, просп. Октября, 71,
e-mail: knyazev@anrb.ru, zilyaver@mail.ru,
alex@anrb.ru, chemeris@anrb.ru

Поступила в редакцию
26 ноября 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало