Сельскохозяйственная биология, 2008, № 5, с. 70-77.

УДК: 633.12:631.53.027.3:581.14+577.11.3

СОДЕРЖАНИЕ ПРОЛИНА В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ ГРЕЧИХИ И ИХ КАЧЕСТВО ПРИ ДЕЙСТВИИ ИМПУЛЬСНОГО ДАВЛЕНИЯ И ПОНИЖЕННЫХ ТЕМПЕРАТУР

А.В. ШИЛЕНКОВ, Н.Г. МАЗЕЙ, E.Э. НЕФЕДЬЕВА, В.Н. ХРЯНИН

Определяли содержание пролина в семенах, их всхожесть и продуктивность полученных растений у гречихи (Fagopyrum esculentum Moenсh., сорт Аромат) при обработке импульсным давлением (ИД) и пониженной температурой. При ИД 11 МПа отмечено увели-чение содержания пролина в семенах в 1,5-4,0 раза и продуктивности растений на 12 %. Воздействие ИД 29 МПа приводило к торможению роста, нарушению метаболизма пролина, гибели до 28 % семян; в то же время продуктивность полученных растений повышалась на 53 %. Температуры +4 и 0 ^оС за 24 ч привели к подавлению всхожести и продуктивности, а температура -4 ^оС — к гибели более 90 % семян, несмотря на 2,5-кратное увеличение содержания пролина. ИД 11 МПа способствовало адаптации семян к действию пониженной тем-пературы, 29 МПа — усиливало повреждающий эффект.

Ключевые слова: Fagopyrum esculentum Moench., импульсное давление, пониженные температуры, пролин, рост, развитие, продуктивность.

Показано, что при стрессирующих воздействиях в клетках растений активируется синтез белков стресса, возрастает содержание растворимых углеводов, стабилизирующих цитоплазму, а также свободной аминокислоты пролина (1). Азот пролина может составлять более половины азота всех свободных аминокислот, а сам он легко вовлекается в окислительные процессы даже при наличии углеводов (2).

Одна из основных функций пролина — защитная. Его гидрофильные группы связываются с гидрофильными участками белков, повышая гидрофильность, что предотвращает их денатурацию и способствует поддержанию оводненности даже при снижении общего содержания воды в клетке (3, 4). Кроме того, пролин осмотически активен. Другая функция связана с влиянием на ростовые процессы: известна корреляция между степенью их затухания и интенсивностью накопления свободного пролина у контрастных по устойчивости к отрицательным температурам растений (5). Торможение роста при этом обусловлено прекращением синтеза оксипролина из пролина и замедлением образования экстенсина — важнейшего белкового компонента клеточных стенок (6).

В синтезе пролина участвуют пирролин-5-карбоксилатсинтетаза (P5CS) (7), орнитинтрансаминаза, НАД(Ф)Н-пирролин-5-карбоксилатредуктаза (8). НАД(Ф)Н-пролиндегидрогеназа (ProDH) катализирует первую и лимитирующую реакцию распада; на последующих этапах происходит накопление глутаминовой кислоты (9). Косвенно в распаде пролина участвует НАД-киназа, ответственная за содержание НАДФ (8).

Поскольку на клеточном уровне пролин защищает ферменты и внутриклеточные структуры, регулирует рН цитозоля, инактивирует свободные радикалы (10), повышение его содержания важно в условиях стресса, а свойство осмопротектора, кроме того, — при пониженных температурах для предотвращения образования кристаллов льда.

Известно также, что обработка семян импульсным давлением (ИД) приводит к повышению продуктивности растений (11).

Целью работы было выявление динамики накопления пролина в связи с развитием стрессовой реакции у прорастающих семян при обработке ИД и пониженными температурами, а также сопряженной устойчивости и продуктивности у растений гречихи.

Методика. Объектом исследования служили семена гречихи (Fago-pyrumesculentum Moenсh.) сорта Аромат. Перед началом исследования их обрабатывали ИД, которое создается ударной волной высокого давления, возникающей при детонации взрывчатого вещества в водной среде. Распространяясь, волна действует на семена, каждое из которых испытывает объемное сжатие в течение 15-25 мкс (12). Давление на фронте ударной волны рассчитывали по формуле:

P = 5330(Q1/3 : R)1,13,

где Р — давление, МПа; Q — масса заряда взрывчатого вещества, кг; R — расстояние от центра взрыва до поверхности семян, м (13). В опытах использовали давления 11 и 29 МПа. В одной кассете находилось до 500 г семян гречихи, что составляло более 17000 шт. (одна повторность). После обработки их подсушивали, хранили не более 1 мес и проращивали.

При исследовании совместного действия ИД и пониженных температур интактные и обработанные ИД семена предварительно проращивали на влажной фильтровальной бумаге в течение 6 ч и подвергали действию пониженных температур (-4 и +4 °С в течение 24 ч в холодильной камере). Для определения количества пролина отбирали часть семян через 6 и 18 ч охлаждения, остальные после 24 ч охлаждения продолжали проращивать при комнатной температуре или высевали в почву.

Содержание пролина измеряли колориметрически (14). Для этого навеску семян массой 0,5 г гомогенизировали в 10 мл 3 % водного раствора сульфосалициловой кислоты. Гомогенат осветляли с использованием бумажного фильтра Ватман 2. Фильтрат (2 мл) помещали в пробирку с притертой пробкой, добавляли 2 мл реагента (1,25 г нингидрина, 30 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл 6 М фосфорной кислоты) и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь инкубировали на водяной бане 1 ч, затем охлаждали до 4 °С. После этого в каждую пробу добавляли по 4 мл толуола, интенсивно встряхивали 20-30 с и давали смеси отстояться. Отделяли окрашенный верхний слой и определяли интенсивность окраски на спектрофотометре СФ-46 (Россия) при λ = 520 нм в сравнении с толуолом. Содержание пролина рассчитывали по калибровочной кривой; стандарт — коммерческий препарат аминокислоты («Sigma», США). Опыты проводили в 3-кратной биологической повторности.

Энергию прорастания и всхожесть определяли проращиванием при температуре 25 °С на фильтровальной бумаге при повышенной влажности воздуха, подсчитывая долю проросших семян соответственно через 4 и 7 сут (ГОСТ 12038-84) (15) относительно общего числа. Представлены средние арифметические и их стандартные ошибки из 4 биологических повторностей по 50 семян в каждой. Продуктивность растений определяли в мелкоделяночном опыте (4 делянки по 1 м² учетной площади), подсчитывая число семян с растения.

Результаты. Содержание пролина в прорастающих семенах гречихи в период 0-48 ч в опыте (обработка ИД) возрастало (табл. 1), в контроле - характеризовалось максимумом в сухих семенах при последующем снижении через 3, 6, 24 и 48 ч проращивания на 35-50 %. Отметим, что через 12 ч наблюдали повышение содержания пролина на 60 % относительно показателя для 6 ч.

Несмотря на значительное изменение содержания воды в семенах при прорастании (см. табл. 1), содержание пролина в контроле было относительно стабильным. Причиной резкого повышения показателя через 12 ч могло быть начало гидролиза запасных веществ, в частности белка эндосперма, который инициируется при достижении критического уровня оводненности — 60 % (16, 17). Кроме того, при гидролизе крахмала образуются растворимые сахара, а накопление пролина, как предполагают, регулируется концентрациями сахарозы и АБК (18). Растворимые соединения, образующиеся при гидролизе, повышают осмотический потенциал клетки, что необходимо для поглощения воды. Экспрессия двух генов, ответственных за синтез ферментов метаболизма пролина, регулируется степенью оводненности, и накапливающийся пролин поддерживает осмотический баланс между клеткой и окружающей средой (7). Имеются данные, что в условиях стресса добавление экзогенного пролина на 30 % повышало выживаемость трансгенных растений арабидопсиса с высокой активностью ProDH (9). В сухих семенах при обработке ИД 11 МПа (см. табл. 1) содержание пролина увеличилось относительно контроля на 80 %, то есть защитные механизмы включились уже в период подсушивания и хранения. Через 3 ч проращивания анализируемый показатель в варианте ИД 11 МПа, как и в контроле, снизился на 44 %, через 6 ч — возрос в 4 раза относительно контроля и в 2 раза относительно предыдущего срока. Семена при ИД 11 МПа достигли критической оводненности (60 %) раньше, чем контрольные (см. табл. 1); повышение осмотической активности в период прорастания могло происходить вместе с накоплением пролина. Действие стрессора, вероятно, способствовало активации гидролитических ферментов, что обычно наблюдается под влиянием γ-, УФ- и лазерного излучения, обработки ускоренными электронами (19, 20). Через 12-48 ч содержание пролина в варианте 11 МПа превышало контроль приблизительно в 2 раза, но снижалось по сравнению с 6 ч на 25-45 %.

В семенах, обработанных ИД 11 МПа, и в контроле выявили аналогичную динамику изменения содержания пролина, но в опыте абсолютные значения содержания аминокислоты были выше, что указывает на адаптивный характер реакции семян на действия ИД 11 МПа.

В этом варианте (ИД 11 МПа) также замедлялось прорастание семян: энергия прорастания на 5-е сут снижалась на 22 % относительно контроля (всхожесть соответствовала контролю) (табл. 2). Следовательно, накопление пролина было результатом процессов, инициируемых при стрессе, и способствовало эффективной защите семян во время прорастания. Развитие комплексной реакции у растений привело к увеличению числа вызревших семян на 12 % (см. табл. 2).

В сухих семенах при ИД 29 МПа (см. табл. 1) содержание пролина соответствовало контролю. Через 3 и 6 ч проращивания в опыте по-казатель не изменился, в контроле — снизился на 35-50 %. Возможно, стабильное содержание пролина связано с подавлением его метаболизма при обработке ИД 29 МПа. Несмотря на то, что поглощение воды в этот период соответствовало контролю (см. табл. 1), видимый рост был замедлен в течение нескольких суток. Известно, что стресс задерживает и даже полностью подавляет прорастание семян, готовых к этому процессу (21). Скачок показателя и достижение критической оводненности (см. табл. 1) при ИД 29 МПа отмечали через 12 ч, что соответствовало контролю. Через 24-48 ч началось снижение содержания пролина относительно величины, зарегистрированной через 12 ч (превышение контроля соответственно в 3,2 и 1,7 раза). В целом увеличение содержания пролина оказалось не таким значительным, как при обработке ИД 11 МПа, однако при этом регистрируемые количественные и качественные изменения отличались от наблюдаемых в контроле, носили длительный характер, что указывало на стойкое повреждение биологических систем. Происходило не только торможение роста, но и гибель части семян (энергия прорастания снизилась на 53, всхожесть — на 28 % относительно контроля). Вероятно, из-за нарушения метаболизма пролина не обеспечивалась защита прорастающего семени. Ранее (11) отмечалось, что воздействие ИД 29 МПа способствует увеличению продуктивности как за счет гибели части малопродуктивных растений, так и вследствие стимуляции выживших. В проведенной серии экспериментов число семян с растения возросло на 53 % (см. табл. 2).

Показано (22), что при низкой положительной температуре в холодоустойчивом каллусе кукурузы аккумулируется свободный пролин и замедляются ростовые процессы, при этом добавление экзогенного пролина усиливает холодостойкость. У озимой пшеницы увеличение количества свободного пролина в узлах кущения было связано с устойчивостью растений к низким отрицательным температурам (5). В наших опытах пониженные температуры также повлияли на накопление пролина в прорастающих семенах (см. табл. 2). Действие температур +4 и 0 °С не различалось, причем содержание пролина было стабильным через 12 и 24 ч (в контроле через 24 ч оно снизилось по сравнению с 12 ч на 38 %) (см. табл. 1). При охлаждении (для температур +4 и 0 °С время проращивания соответственно 12 и 24 ч, время охлаждения — 6 и 18 ч) отмечали рост анализируемого показателя соответственно на 45-44 и 106-112 % относительно контроля. Температура -4 °С оказала большее влияние на накопление пролина: его количество повысилось на 69 и 158 % относительно контроля соответственно для режимов 12(6) и 24(18) ч (перед скобками приведено время проращивания, в скобках — время охлаждения) (см. табл. 2). Следовательно, пониженные температуры оказали значительное воздействие не только на изменение содержания пролина, но и на динамику его накопления.

Показатели прорастания семян и продуктивности растений в вариантах +4 и 0 °С изменялись аналогичным образом (см. табл. 2): энергия прорастания снизилась соответственно на 23 и 31 %, всхожесть — на 17 и 19 % относительно контроля. Обе температуры проявили сильное травмирующее действие, что выразилось в снижении числа вызревших семян по сравнению с контролем соответственно на 57 и 89 %. Температура -4 °С оказалась губительной (энергия прорастания — 2, всхожесть — 6 %, что не позволило достоверно оценить продуктивность растений) (см. табл. 2). Подавление роста, продукционного процесса и увеличение содержания пролина под действием пониженной температуры зависели от дозы стрессора. Своеобразие реакции на ИД (в отличие от реакции на пониженную температуру) заключалось в более существенном увеличении содержания пролина в семенах при отсутствии эффекта дозы и положительном влиянии ИД на продукционный процесс.

При совместном действии ИД и пониженной температуры отмечали самое высокое содержание пролина в прорастающих семенах (см. табл. 2). При сочетании ИД 11 МПа и температуры +4 °С, исходя из того, что обработка ИД через 12 ч привела к повышению содержания пролина на 88, а действие температуры +4 °С — на 45 % по сравнению с контролем, можно было ожидать суммарный эффект 133 %. Однако реальное увеличение содержания пролина составило 151 %. Аналогичную закономерность отмечали и через 24 ч. Возможно, ИД активировало реакцию на стресс, а действие пониженной температуры усилило ее. Следовательно, при реакции на ИД 11 МПа не был исчерпан весь адаптивный резерв прорастающих семян, а ответ на пониженную температуру был инициирован по иному механизму. ИД 11 МПа в сочетании с температурой 0 °С привело к накоплению пролина в меньшем количестве, чем ожидалось теоретически. В этом варианте абсолютное содержание пролина было ниже, чем в предыдущем, что не соответствовало общей закономерности. Следовательно, ведущую роль здесь играло именно совместное влияние факторов, а не действие каждого из них по отдельности. При ИД 11 МПа в сочетании с температурой -4 °С абсолютные значения содержания пролина были близкими к таковым в варианте ИД 11 МПа в сочетании с +4 °С, но прирост показателя относительно контроля не превышал теоретически рассчитанной суммы. Такое количество пролина соответствовало пределу метаболических возможностей семян.

Применение ИД 11 МПа способствовало адаптации к пониженной температуре, что проявилось в увеличении всхожести семян и числа семян с растения при обработке совместно ИД 11 МПа и температурами +4, 0 и -4 °С (по сравнению с применением только пониженной температуры) (см. табл. 2). ИД 29 МПа, наоборот, усилило повреждающий эффект пониженных температур, что приводило к снижению всхожести при совместном воздействии (см. табл. 2). Показатели продуктивности в этом варианте не обсуждаются из-за низкой всхожести семян.

Влияние ИД 29 МПа в сочетании с температурой +4 °С проявилось в повышении содержания пролина до соответствующего теоретической сумме эффектов и было одним из самых высоких в серии опытов. При этом реакция прорастающих семян ограничивалась метаболическими возможностями образования пролина. Было обнаружено сходство реакции прорастающих семян, обработанных ИД 29 МПа, на температуры 0 и -4 °С: в обоих случаях увеличение содержания пролина оказалось меньше теоретически рассчитанной суммы, несмотря на высокие абсолютные значения показателя.

При действии ИД 11 МПа (в отличие от ИД 29 МПа) не были исчерпаны потенциальные метаболические возможности семян при прорастании. Видимо, в последнем случае нарушение метаболизма пролина сохраняется не только в период 0-6 ч, но и позже, на что указывает относительно небольшой вклад пониженных температур в увеличение содержания этой аминокислоты при совместном действии с ИД.

Таким образом, импульсное давление (ИД) при воздействии на семена в малых дозах (11 МПа) приводит к увеличению продуктивности на 12 % без значительных повреждений и способствует адаптации растения ко второму фактору — пониженной температуре. Существенную роль в адаптации и сопряженной устойчивости играет пролин. Воздействие ИД 29 МПа вызывает торможение роста, нарушение метаболизма пролина и гибель до 28 % семян, но инициирует у выживших растений компенсаторные механизмы, обусловливающие увеличение продуктивности на 53 %, а доза ИД усиливает повреждающий эффект пониженных температур. Пониженные температуры (+4 и 0 °С) при действии в течение 24 ч способны значительно снизить всхожесть семян (до 58 и 57 %) и продуктивность растений (соответственно в 2,3 и 9,4 раза), а температура -4 °С вызывает гибель более 90 % семян, несмотря на существенное увеличение содержания пролина во время обработки. Имеются принципиальные различия в реакции растений на ИД и пониженные температуры. Эффект дозы отсутствует в отношении динамики пролина и продуктивности при ИД, но проявляется при действии пониженной температуры. При совместном влиянии двух факторов результирующий эффект не является простой суммой составляющих.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Ю р к е в и ч Л.Н., П о т о п о л ь с к и й А.И. Пролин как фактор устойчивости растений к засолению. Физиол. и биохим. культ. раст., 1994, 26(6): 600-605.
2. Б р и т и к о в Е.А. Биологическая роль пролина. М., 1975.
3. S c h o b e r f В., T s c h e s c h e H. Unusual solution properties of proline and its interaction with proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1978, 541(2): 270-277.
4. S t e w a r t С.R., B o g g e s s S.F. Metabolism of proline by barley leaves and its use in measuring the effects of water on proline oxidation. Plant Physiol., 1978, 61(4): 654-657.
5. П е р у а н с к и й Ю.В., С т а ц е н к о А.П. Свободный пролин вегетативных органов - биохимический показатель морозостойкости озимой пшеницы. С.-х. биол., 1981, 16(5): 740-743.
6. T i e r n e y M. L., V a r n e r J. E. The extensions. Plant Physiology, 1987, 84, 1(L-P): 1-2.
7. HayashiF., Ichino T., Osanai M. е.а.Oscillation and regulation of proline content by P5CS and ProDH gene expressions in the light/dark cycles in Arabidopsis thaliana L. Plant Cell Physiol., 2000, 41(10): 1096-1101.
8. G u e r r i e r G., D e l u m e a u O., R e n a r d M. e.a. Proline metabolism and NAD kinase activity in soybean calli during short- and long-term exposures to light and NaCl. Biologia Plantarum, 1997, 40(1): 1-9.
9. M a n i S., V a n d e C o t t e B., V a n M o n t a g u M. e.a. Altered levels of proline dehydrogenase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis. Plant Physiol., 2002, 128(1): 73-83.
10. Ф р а н к о О.Л., М е л о Ф.Р. Осмопротекторы: ответ растений на осмотический стресс. Физиол. раст., 2000, 47(1): 152-159.
11. Н е ф е д ь е в а Е.Э., М а з е й Н.Г., М и р о ш н и ч е н к о А.А. и др. Содержание фитогормонов, рост и развитие растений гречихи под действием импульсного давления. С.-х. биол., 2003, 1: 54-61.
12. А т р о щ е н к о Э.С., Х р я н и н В.Н., А т р о щ е н к о Е.Э. и др. Патент RU 2083073 С1 6АО 1/100 АО1G 7/04. Способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур. Опубл. 10.07.1997, Бюл. № 19.
13. П и х т о в н и к о в Р.Е., З а в ь я л о в а В.И. Штамповка листового материала взрывом. М., 1964.
14. B a t e s L.E., W a l d r e n R.P., T e a r e I.D. Rapid determination of free proline for waterstress studies. Plant and soil, 1973, 39(1): 205-207.
15. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести: ГОСТ 12038-84. (введ. 01.07.86).
16. О б р у ч е в а Н.В., А н т и п о в а О.В., И в а н о в а И.М. Запуск роста осевых органов и его подготовка при прорастании семян, находящихся в вынужденном покое. I. Накопление осмотически активных веществ в осевых органах семян кормовых бобов. Физиол. раст., 1993, 40(5): 742-748
17. А л е к с е е в а Е.С., П а у ш е в а З.П. Генетика, селекция и семеноводство гречихи. 2-е изд., перераб. и доп. Киев, 1988.
18. V e r s l u e s P.E., B r a y E.A. Role of abscisic acid (ABA) and Arabidopsis thaliana ABA-insensitive loci in low water potential-induced ABA and proline accumulation. J. Exp. Bot., 2005, 57(1): 201.
19. К и с е л е в а Т.А. Влияние γ-радиации на рост, развитие и биохимические показатели проростков ячменя Тез. докл. науч.-практ. конф. «Экология и охрана окружающей среды». Пермь, 1995: 64-68.
20. G a l o v a Z. The effect of laser beams on the process of germinating power of winter wheat grains. Rocz. AR Poznoniu Pol., 1996, 49: 39-43.
21. Х а н А.А. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. М., 1982.
22. D u n c a n D.R., W i d h o l m J.М. Proline accumulation and its implication in cold tolerance of regenerate maize callus. Plant Physiol., 1987, 83(3): 703-708.

PROLINE CONTENT IN SPROUTING SEEDS OF BUCKWHEAT AND THEIR QUALITY UNDER ACTION OF PULSE PRESSURE AND LOW TEMPERATURES

A.V. Shilenkov, N.G. Mazei, E.E. Nefed’eva, V.N. Khryanin

The authors determined the proline content in seeds, their germinating capacity and pro-ductivity of obtained plants in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moenсh., the Aromat variety) after treatment by pulse pressure (PP) and low temterature. At the PP of 11 MPa the proline content raises in seeds to 1.5-4.0-fold and the increase of productivity is 12 %. The action PP of 29 MPa causes the inhibition of growth, proline metabolism and death to 28 % of seeds; at the same time the productivity of obtained plants raised on 53 %. The temperatures +4 and 0 ^оC during 24 hours result in inhibition of germinating capacity and productivity, the temperature -4 ^оC result in the death more than 90 % of seeds in spite of 2.5-fold increase in proline content. PP of 11 MPa promote to adaptation of seeds to action of low temperature, 29 MPa — increases the damaging effect.

Key words: Fagopyrum esculentum Moench., pulse pressure, low temperature, proline, plant growth and development, fruitage

Оформление электронного оттиска