УДК 633.491:632.938.2:58.02

ЗАРАЖЕНИЕ КАРТОФЕЛЯ ВОЗБУДИТЕЛЕМ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ ПРИ ПОНИЖЕННЫХ И ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

И.А. ГРАСКОВА, И.В. АНТИПИНА, О.Ю. ПОТАПЕНКО, В.К. ВОЙНИКОВ

Изучали активность слабо связанных с клеточной стенкой пероксидаз у сортов картофеля, контрастных по устойчивости к заражению возбудителем кольцевой гнили Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, при пониженной и повышенной температуре. Показано, что положительные низкие температуры почвы способствуют поражению растений картофеля кольцевой гнилью.

Ключевые слова: картофель, кольцевая гниль, патогенез.

 

Возбудитель кольцевой гнили картофеля — грамположительная бактерия Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (1). Болезнь распространена в основных районах выращивания культуры (европейская часть России, Украина, Белоруссия, Сибирь, Дальний Восток, Казахстан), сопровождается потерями урожая, которые достигают 45 %, поражает вегетирующие растения и клубни в период хранения. По сосудам возбудитель проникает из больного материнского клубня в стебли, накапливается в сосудах, вызывая их закупорку и, как следствие, постепенное увядание листьев и стебля. Скрытые инфекции могут сохраняться на протяжении трех генераций, накапливаться в почве или на тканях растения.

Установлено, что патологический процесс связан также с выделением Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus экзополисахаридов (2). При инфицировании клубни сгнивают или из них вырастают неполноценные растения, у которых отсутствует клубнеобразование. В последние годы вредоносность заболевания несколько уменьшилась благодаря программе сертификации семенного материала и использованию устойчивых сортов (3), однако проблема все еще остается актуальной.

Появление симптомов заболевания в значительной степени зависит от условий среды, штамма патогена, инфекционной нагрузки и сорта картофеля.

Известно, что при изменении теплообеспеченности и перепадах температуры метаболизм растений также изменяется: ограничивается или прекращается рост, увеличивается содержание абсцизовой кислоты и антиоксидантов, модифицируется липидный состав мембран, накапливаются совместимые осмолиты (пролин, бетаин, полиолы и растворимые сахара) (4). В частности, активность и набор изоформ пероксидаз значительно варьируют при воздействии стрессовых факторов. В условиях повышенной и пониженной температуры, а также в присутствии патогена активность этого фермента повышается. В литературе есть данные об изменение активности и изоферментного состава пероксидазы под влиянием каждого из двух упомянутых факторов, но сведения о состоянии фермента при двойном стрессе крайне ограничены.

В представляемой работе изучали изменение активности слабо связанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензионных клетках растений картофеля контрастных по устойчивости сортов при заражении патогеном в условиях повышенной и пониженной температуры.

Методика. Объектом исследований служили растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов Луговской и Лукьяновский (соответственно устойчивый и восприимчивый к патогену). Пробирочные растения выращивали из черенков на агаризированной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением гормонов и витаминов (5) в климатической камере с контролируемым режимомСуспензию клеток готовили из каллусов, полученных из листовых тканей тех же сортов картофеля. Для опыта суспензионные клетки культивировали при постоянном встряхивании при различных температурных режимах (4, 25 и 36 °С). В контроле добавляли чистую стерильную среду для культивирования, в других вариантах — суспензию патогена (6).

Использовали штамм 5369 (вирулентный, агрессивный) Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kotth.) Skapt et Burkh. Бактерии культивировали на твердом картофельном агаре с 1,5 % глюкозы (5) в течение 5-6 сут, затем стационарно (без аэрации) на жидкой картофельной  среде с 1,5 % глюкозы (5) в течение 3 сут при 25 °С. После этого колбы с культурами помещали в термостат (4, 25 и 38 °С) и каждые сутки подсчитывали титр бактериальных клеток.

Суспензионные культуры клеток картофеля выращивали с добавлением патогена при температурах 4, 25 и 36 °С. Для подавления синтеза пероксидазы использовали ингибитор белкового синтеза — циклогексимид (5 мг/л) и специфический ингибитор РНК-полимеразы II — a-аманитин. Для экстракции внеклеточных пероксидаз навески по 1 г клеток картофеля помещали в шприц, добавляли 10 мл холодного цитратно-фосфатного буфера (0,1 М, рН 6,2 в варианте с устойчивым и рН 5,4 — с восприимчивым сортом) и дважды подвергали вакуумной фильтрации по 1 мин. В фильтрате определяли пероксидазную активность по А.Н. Бояркину (7) при 25 °С. Пробы суспензионных клеток отбирали каждые 5 мин в 1-й ч культивирования и через каждые 30 мин в последующие 2 ч. Количество белка определяли по методу O.H. Lowry (8).

Результаты. При пониженной температуре (4 °С) скорость роста бактерий была невысокой (начальный титр — 75,5×108, на 9-е сут — 225,5×108), при оптимальной (25 °С) наблюдали нарастание титра в течение 4 сут, после чего рост замедлялся (далее титр существенно не изменялся), при повышенной (38 °С) отмечали резкий рост титра в течение 5 сут, затем он снижался и многие клетки гибли (рис. 1).

Граскова 1.jpg

Рис. 1. Динамика роста числа бактерий Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus (штамм 5369) при разной температуре культивирования в жидкой картофельной среде: 1, 2 и 3 — соответственно 4, 25 и 38 °С.

Известно, что при патогенезе в растительной клетке происходит так называемый окислительный взрыв, который сопровождается увеличением содержания активных форм кислорода (АФК), подавляющих развитие патогена. Внеклеточная пероксидаза, способная продуцировать АФК, связана с клеточной стенкой растения сравнительно слабо и активируется при бактериальной инфекции (7). Ранее мы показали (6), что при поражении растений картофеля кольцевой гнилью активность слабо связанной с клеточной стенкой пероксидазы неодинакова у устойчивого и восприимчивого сорта. Кривые изменения активности внеклеточных пероксидаз в присутствии штамма возбудителя при оптимальной температуре культивирования характеризовались двумя пиками: первый (через 10-20 мин после инфицирования) у устойчивого сорта не зависел от синтеза белка и, вероятно, отражал активацию внеклеточных пероксидаз, имевшихся на поверхности клеток до инфицирования (6), второй (через 1,5-2,0 ч после инфицирования) у обоих исследованных сортов был связан с синтезом белка, то есть обусловлен реакцией генома на патогенез. То есть выявленные различия могут быть связаны с разной резистентностью исследуемых сортов картофеля, а высокая активность внеклеточных пероксидаз — служить маркером устойчивости сорта к патогену (6).

Граскова 2А.jpg Граскова 2Б.jpg

Рис. 2. Динамика активности слабо связанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из культуры клеток растений картофеля контрастных по устойчивости к кольцевой гнили сортов, при низко- и высокотемпературом стрессе: А и Б — культивирование соответственно при 4 и 36 °С (вместо 38 °С, поскольку эта температура губительна для культуры клеток); 1 и 2 — сорт Луговской (устойчивый) соответственно в присутствии патогена и в контроле; 3 и 4 — сорт Лукьяновский (восприимчивый) соответственно в присутствии патогена и в контроле. Патоген — Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (штамм 5369).

При оценке совместного действия низкотемпературного стресса и патогена у устойчивого сорта при 4 °С в контроле (без возбудителя) активность внеклеточной пероксидазы уменьшалась через 10-15 мин и далее в течение 3 ч существенно не изменялась (рис. 2). Добавление патогена вызывало увеличение активности фермента в течение 1-го ч с последующим сохранением достигнутого показателя. У восприимчивого сорта ни понижение температуры, ни дополнительное внесение патогена не приводило к существенному изменению активности фермента в течение 3 ч (см. рис. 2).

Граскова 3.jpg

Рис. 3. Динамика активности слабо связанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из культуры клеток растений картофеля устойчивого сорта Луговской при температуре культивирования 38 °С: 1 — контроль (без патогена); 2, 3 и 4 — культивирование соответственно с патогенном, с патогеном и циклогексимидом, с патогеном и a-аманитином. Патоген — Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus (штамм 5369).

При изучении влияния высокотемпературного стресса и присутствия патогена у восприимчивого сорта активность внеклеточной пероксидазы незначительно возрастала в течение 1-го ч культивирования, а добавление штамма-возбудителя приводило к увеличению активности в первые 40 мин сокультивирования (см. рис. 2). У устойчивого сорта картофеля при температуре культивирования клеточной суспензии 38 °С активность внеклеточной пероксидазы увеличивалась в течение 1-го ч и затем существенно не изменялась. Добавление патогена приводило к резкому повышению активности в течение 1-го ч и через 1,5-2,5 ч культивирования при примерно одинаковой величине пиков (рис. 3).

При патогенезе резкий рост активности фермента может зависеть от его синтеза de novo (9). Добавление в среду культивирования ингибитора белкового синтеза — циклогексимида и ингибитора синтеза мРНК a-аманитина не влияло на активность внеклеточной пероксидазы в течение 1-го ч после заражения в культуре клеток устойчивого сорта Луговской, но значительно снижало ее через 1,5-2,5 ч после начала культивирования (см. рис. 3), следовательно, отмеченное повышение активности спустя 1,5 ч после заражения может зависеть от синтеза фермента de novo.
Таким образом, в культуре клеток растений картофеля восприимчивого сорта пониженная температура не влияет на активность внеклеточной пероксидазы, устойчивого — вызывает ее незначительное увеличение.  В то же время бактерии штамма-возбудителя кольцевой гнили хорошо растут при пониженной температуре, то есть при посадке картофеля в холодную землю может происходить его заражение. При высоких температурах в культуре клеток устойчивого сорта наблюдалось резкое повышение активности фермента как фактора защиты от патогена.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. П о п к о в а  К.В.,  Ш н е й д е р  Ю.И.,  В о л о в и к  А.С. и др. Болезни картофеля. М., 1980.
2. Р о м а н е н к о  А.С.,  Г р а с к о в а  И.А.,  Е к и м о в а  Е.Г. и др. Обладает ли токсин возбудителя кольцевой гнили картофеля свойствами элиситора, инициирующего защитные ответы? ДАН, 1997, 355: 844-845.
3. N i s s i n e n  R.,  L a i  F.-M.,  L a i n e  M.J. e.a. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus elicits a hypersensitive response in tobacco and secretes hypersensitive response-inducing protein(s). Phytopathology, 1997, 87: 678-684.
4. Г и м а л о в  Ф.Р.,  Ч е м е р и с  А.В.,  В а х и т о в  В.А. О восприятии растением холодового сигнала. Усп. совр. биол., 2004, 124: 185-196.
5. Б у т е н к о  Р.Г.,  Х р о м о в а  Л.М.,  С е д н и н а  Г.В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у различных сортов картофеля. М., 1984.
6. G r a s k o v a  I.A.,  A n t i p i n a  I.V.,  P o t a p e n k o  O.Y. e a. Pathogen impact on the activity dynamics of potato suspension cells extra-cellular peroxidase. J. Stress Physiol. Biochem., 2005, 1(1): 15-20.
7. Б о я р к и н  А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы. Биохимия, 1951, 16(4): 352-355.
8. L o w r y  O.H.,  R o s e b r o u g h  N.J.,  F a r r  A.L. e.a. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193: 265-275.
9. М и н и б а е в а  Ф.В.,  Г о р д о н  Л.Х. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе. Физиол. раст., 2003, 50(3): 459-464.

 

POTATO INFECTION BY RING ROT AGENT AT THE LOW AND HIGH TEMPERATURES

I.A. Graskova, I.V. Antipina, O.Yu. Potapenko, V.K. Voinikov

The poorly bound with cell wall peroxidase activity was investigated in connection with tolerance of potato varieties to infection by Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus at the low and high temperatures. It was shown, that positive low temperature of soil promote to infection of potato plants by ring rot.

Key words: potato, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, pathogenesis.

Сибирский институт физиологии и
биохимии растений СО РАН
,
664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132,
e-mail: Graskova@sifibr.irk.ru

Поступила в редакцию
3 октября 2006 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало