doi: 10.15389/agrobiology.2021.4.707rus
УДК 636.11.15:619:579.62:577.2
ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗОЛЯТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЫТА ЛОШАДЕЙ
В УСЛОВИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА
М.П. НЕУСТРОЕВ1 ✉, С.Г. ПЕТРОВА1, Е.И. ЭЛЬБЯДОВА1,
Н.П. ТАРАБУКИНА1, В.А. АЛЕКСЕЕВ2, А.А. ПОПОВ1
Увеличение поголовья и продуктивности в табунном коневодстве сдерживается рядом факторов, среди которых значительное место занимают инфекционные и инвазионные болезни. Наиболее распространенным и причиняющим ощутимый экономический ущерб заболеванием остается мыт лошадей (возбудитель Streptococcus equi). Заболевание широко распространено в странах азиатского континента, в России и странах СНГ. Для разработки вакцинного препарата против болезни важное значение имеет выделение ее возбудителя. В настоящей работе впервые в условиях Крайнего Севера выделены и идентифицированы три новых изолята возбудителя мыта Streptococcus equi, которые могут быть использованы для диагностики и разработки вакцины против мыта лошадей. Целью работы было выделение, изучение, идентификация по морфологическим, культуральным, биохимическим, молекулярно-генетическим свойствам новых изолятов возбудителя мыта лошадей для диагностики заболевания в условиях Крайнего Севера и разработки вакцины. Биологические пробы были собраны в 2015-2017 годах в хозяйствах Республики Саха (Якутия) (Намский, Хангаласский, Амгинский, Мегино-Кангаласский районы, г. Якутск), а также в Республике Казахстан. Всего исследовали 63 пробы от 6-10-месячных лошадей (Equus ferus caballus) якутской и казахской пород, в том числе 45 смывов носовых истечений (27 от клинически больных мытом жеребят, 18 от здоровых жеребят), 7 проб содержимого вскрывшихся абсцессов подчелюстных лимфатических узлов и 11 паренхиматозных органов павших от мыта жеребят. Перед бактериологическими исследованиями применяли предпосевную обработку. Морфологические и культуральные свойства изолятов изучали при высеве в мясопептонный бульон (МПБ) с 1 % глюкозой и 10 % лошадиной сывороткой, а также на мясопептонный агар (МПА) с 1 % глюкозой и 10 % сывороткой крови или 5 % дефибринированной кровью лошади. Мазки из гноя, препараты, приготовленные из культур, выращенных в жидкой и на агаризованной среде, фиксировали и окрашивали по Граму. Биохимические свойства культур исследовали при высеве на MПA с 40 % желчью, 6,5 % солевой MПA, агар с азидом натрия и среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой, сахарозой, сорбитом и дульцитом. Видовую принадлежность изолятов определяли по биохимическим свойствам культуры с использованием стрипов API 20 Step тест системы API («bioMerieux», Франция). Вирулентную активность стрептококков определяли на белых беспородных мышах, которым подкожно вводили взвесь суточной культуры живых бактериальных клеток стрептококков в объеме 0,2-0,5 см3 (от 1×103 до 1×109 КОЕ/гол). ДНК выделяли из жидкой бактериальной культуры. Генетическое типирование изолятов Streptococcus выполняли методом ПЦР со штамм-специфическими праймерами Seel-F 5ʹ-CGGATACGGTGA-TGTTAAAGA-3ʹ и Seel-R 5ʹ-TTCCTTCCTCAAAGCCAGA-3ʹ. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Streptococcus equi была секвенирована для шести изолятов мытного стрептококка, из которых три предлагается использовать для разработки вакцинных препаратов. Полимеразная цепная реакция со специфическими праймерами служит наиболее достоверным и быстрым методом идентификации мытного стрептококка. По результатам генотипирования и изучения культуральных, морфологических и биохимических свойств установлено, что изолят Н-5/1 относится к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus, виду Streptococcus equi ssp. equi и соответствует типовым характеристикам представителей этого вида. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S рРНК изолята Н-5/1 после секвенирования депонирована в базе данных NCBI GenBank (MW486609). На основании проведенных исследований штамм Streptococcus equi Н-5/1 депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ ВГНКИ (регистрационный номер ВКШМ-Б-141П, справка о депонировании от 22 мая 2018 года). Получен патент на изобретение № 2703485 «Штамм бактерий Streptococcus equi, используемый для изготовления вакцины против мыта» от 17.10.2019 года. Новые изоляты Streptococcus equi могут быть использованы для разработки диагностических препаратов и вакцины против мыта лошадей. Также от клинически больных мытом жеребят были выделены культуры Enterococcus faecales, Streptococcus piogenes, токсигенные и плесневые грибы родов Aspergillus и Mucor, что необходимо учитывать при диагностике и профилактике мыта и других респираторных болезней молодняка лошадей.
Ключевые слова: мыт лошадей, стрептококк, Streptococcus equi, биохимиеские признаки, генотипирование, якутские породы, Сибирь, Крайний Север, бактериальные инфекции.
IDENTIFICATION OF NEW ISOLATES OF THE HORSE STRANGLES CAUSATIVE AGENT IN NORTHERN SIBERIA
M.P. Neustroev1 ✉, S.G. Petrova1, E.I. Elbyadova1, N.P. Tarabukina1,
V.A. Alekseev2, A.A. Popov1
Infectious and invasive diseases cause significant damage to the economy and decrease the productivity of horse herd farming. Equine strangles (Streptococcus equi) is the most economically damaging. Specific prevention of the disease widespread in Asia, Russia and CIS poses a serious problem. In this work, for the first time in the Far North, we isolated and identified three new Streptococcus equi strains prospective for the diagnostics and development of strangles vaccines. The study aimed to culture, identify morphologically, culturally, biochemically, and genotypically new isolates of the equine strangles causative agent for the development of vaccines. A survey of 6-10-month old Yakut and Kazakh foals (Equus ferus caballus) was performed in the Republic of Sakha (Yakutia) regions (the farms in Namskiy, Khangalasskiy, Amginskiy, Megino-Kangalarskiy districts and in Yakutsk) and in Kazakhstan in 2015-2017. In total, 63 collected biospecimens included 45 nasal discharges (27 from diseased and 18 from healthy foals), 7 submandibular lymph node abscesses, and 11 parenchymal organs. The infectious agents were isolated and identified by 16S rDNA genotyping using PCR and based on biochemical traits. Morphological and cultural properties were studied using meat peptone broth (MPB) added with 1 % glucose and 10 % horse blood serum and on meat peptone agar (MPA) with 1 % glucose and 10 % horse blood serum or 5 % defibrinated horse blood. Pus swabs and preparations of liquid and agar cultures stained by the Gram procedure were investigated with a light microscope. Biochemical properties were studied by plating on MPA with 40 % bile, 6.5% saline MPA, agar with sodium azide, and Giss’s medium with glucose, lactose, mannitol, maltose, sucrose, sorbitol, and dulcite. The isolates were biochemically assigned to species using API 20 Step strips (an API test system, bioMerieux, France). The virulence of the isolates (LD50) was assessed on white mice challenged subcutaneously with 0.2-0.5 cm3 of 1-day suspensions (1×103 to 1×109 CFU per mouse). Genotyping was performed with specific primers Seel-F 5ʹ-CGGATACGGTGAT-GTTAAAGA-3ʹ and Seel-R 5ʹ-TTCCTTCCTCAAAGCCAGA-3ʹ. The Streptococcus equi 16S rRNA gene was sequenced for six isolates of strangles streptococcus, of which three we suggest for the development of strangles vaccines. Polymerase chain reaction with specific primers serves as the most reliable and fastest method for identifying strangles streptococcus. Based on genotyping data and the cultural, morphological and biochemical properties, the Streptococcus equi H-5/1 isolate belongs to the Streptococcaceae family, Streptococcus genus, Streptococcusequi ssp. equi and corresponds to the typical characteristics of the species. The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene fragment of the isolate H-5/1 after sequencing was deposited in the NCBI GenBank database (MW486609). The Streptococcus equi H-5/1 strain was deposited in the All-Russian State Collection of Microorganism Strains Used in Veterinary Medicine and Animal Husbandry (VGNKI, registration number VKSHM-B-141P, certificate of deposit dated May 22, 2018), and patent for invention No. 2703485 (“A strain of bacteria Streptococcus equi used for the production a vaccine against strangles”) dated 10/17/2019 was received. The new Streptococcus equi strains we described here hold promise in the developing strangles vaccines. Note, Enterococcus faecales, Streptococcus piogenes, toxigenic and mold fungi Aspergillus and Mucor genera were also isolated from foals with clinical sings of equine strangles. Our findings attract attention to these microorganisms possibly involved in the development of equine strangles in young horses, which should be accounted in diagnostics of this pathology.
Keywords: equine strangles, streptococcus, Streptococcus equi, biochemical traits, genotyping, Yakut horses, Kazakh horses, Siberia, the Far North, bacterial infections.
1ФГБУН ФИЦ ЯНЦ СО РАН Якутский НИИ |
Поступила в редакцию |
