doi: 10.15389/agrobiology.2021.4.619rus
УДК 636.2:591.1:579.62:575:577.2
Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ № 20-016-00168 «Исследование особенностей экспрессии генов метаболизма микробного сообщества рубца крупного рогатого скота под влиянием различных кормовых факторов».
БИОРАЗНООБРАЗИЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ МИКРОБИОМА РУБЦА У МОЛОЧНЫХ КОРОВ В РАЗНЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПЕРИОДЫ
Г.Ю. ЛАПТЕВ, Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ, Т.П. ДУНЯШЕВ, Л.А. ИЛЬИНА,
Д.Г. ТЮРИНА, В.А. ФИЛИППОВА, Е.А. БРАЖНИК, Н.В. ТАРЛАВИН,
А.В. ДУБРОВИН, Н.И. НОВИКОВА, В.Н. БОЛЬШАКОВ,
Е.С. ПОНОМАРЕВА
В условиях интенсификации скотоводства негативное влияние на микробиоту рубца и, как следствие, на физиологию крупного рогатого скота оказывает совокупность стресс-факторов, в частности экстремально высокая молочная продуктивность, несогласованность нейрогуморальной и гормональной регуляции потребления корма и синтеза молока, отрицательный энергетический баланс, использование кормов, содержащих избыточное количество крахмала. В представленной работе впервые показано, что физиологические периоды у молочного скота — это важный фактор, определяющий относительное изобилие неатрибутируемых бактерий из кандидатных семейств vadinBE97 и WCHB1-41, функции которых практически не изучены. Наиболее выраженные изменения метаболического потенциала микробиоты, а именно угнетение различных типов обмена веществ в химусе рубца, в частности энергетического (цикл трикарбоновых кислот), белкового, углеводного, липидного, включая синтез летучих жирных кислот (ЛЖК), наблюдаются у коров в период стабилизации и спада лактации по сравнению с сухостойными, новотельными и раздойными животными. Цель работы — изучение состава и метаболического потенциала микробиома рубца у коров молочного направления в различные физиологические периоды. Эксперимент проводили летом 2020 года в АО «Агрофирма Дмитрова Гора» (Тверская обл.) на 15 коровах (Bos taurus) молочного направления черно-пестрой голштинизированной породы 2-3-й лактации. Животные были разделены на пять групп (по n = 3): I группа — сухостойные (в среднем за 30 сут до отела), II — новотельные (среднее число дней доения — 20), III — в период раздоя (среднее число дней дое-ния — 90), IV — в период стабилизации лактации (208-е сут лактации), V — в период спада лактации (310-е сут лактации). Рационы коров рассчитывали в программе AMTS.Cattle.Professional в соответствии с общепринятыми требованиями. Тотальную ДНК из образцов химуса рубца выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва). Оценку бактериального сообщества рубца проводили методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с применением праймеров для V3-V4 региона 16S рРНК. Секвенирование осуществляли с использованием реагентов для подготовки библиотек Nextera® XT IndexKit («Illumina, Inc.», США), для очистки ПЦР продуктов Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter, Inc.», США) и для проведения секвенирования MiSeq® ReagentKit v2 (500 cycle) («Illumina, Inc.», США). Биоинформатический анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения Qiime2 ver. 2020.8. Фильтрацию шумовых последовательностей проводили методом Deblur. Для построения филогении de novo применяли программный пакет MAFFT. Для анализа таксономии использовали справочную базу данных Silva 138 (https://www.arb-silva.de/documentation/release-138/). Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома осуществляли при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0). Для анализа метаболических путей и ферментов пользовались базой данных MetaCyc. Тотальную РНК из образцов рубцового содержимого выделяли с помощью набора Aurum Total RNA («Bio-Rad», США). На матрице РНК получали кДНК (набор iScript RT Supermix, «Bio-Rad», США). Относительную экспрессию генов Ldh-L и Ldb 0813 бактерий определяли в количественной ПЦР. Реакцию амплификации с праймерами гена Ldb 0813, связанного с синтезом D-лактатдегидрогеназы, и L-лактатдегидрогеназы (ген Ldh-L) проводили при помощи набора SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix («Bio-Rad», США). В результате 16S метагеномного секвенирования содержимого рубца показано снижение a-разнообразия бактериальной микробиоты у коров из IV и V групп (р ≤ 0,05). Обнаружены 12 суперфилумов и филумов микроорганизмов. Суперфилум Bacteroidota и филум Firmicutes были определены как «доминантные» бактерии рубца (соответственно до 59,94±1,86 и 46,82±14,40 % сообщества). Бактерии суперфилума Actinobacteriota полностью элиминировались из рубца лактирующих коров, присутствуя только в рубце сухостойных животных. Бактерии суперфилума Armatimonadota исчезали из рубца новотельных коров и животных в период стабилизации лактации, филума Chloroflexi — в периоды раздоя и стабилизации лактации. Выявлены существенные различия между животными по 8 бактериальным семействам, в том числе Muribaculaceae, Prevotellaceae, Erysipelatoclostridiaceae, Oscillospiraceae, Ruminococcaceae, Saccharimonadaceae, кандидантым семействам WCHB1-41, vadinBE97. Обнаружено появление в составе микробиома коров в новотельный период и персистирование в последующие периоды лактации родов Asteroleplasma, Sharpea, Moryella, Oribacterium, Shuttleworthia. Эти бактерии отсутствовали в составе микробиома рубца в период сухостоя. Предсказанный функциональный потенциал 17 метаболических путей микробиома различался (р ≤ 0,01) у коров из разных опытных групп. Наиболее выраженные изменения, а именно угнетение разных типов обмена веществ в химусе рубца, наблюдались у коров из IV и V групп в сравнении с I, II и III группами (р ≤ 0,01). У новотельных животных по сравнению с сухостойными в рубце повышалась экспрессии генов, связанных с синтезом лактатдегидрогеназ, Ldh-L (p ≤ 0,01) и Ldb 0813 (p ≤ 0,05). У бактериального сообщества рубца коров значительно усиливалась экспрессия генов Ldh-L (в 10,6 раза при p ≤ 0,001) и Ldb 0813 (в 2,8 раза при p ≤ 0,05) в период спада лактации по сравнению с показателями в IV группе.
Ключевые слова: микробиом рубца, жвачные, молочные коровы, рационы, крахмал, клетчатка, NGS-секвенирование, PICRUSt2, MetaCyс, метаболические пути.
G.Yu. Laptev, E.A. Yildirim ✉, T.P. Dunyashev, L.A. Ilyina, D.G. Tyurina, V.A. Filippova, E.A. Brazhnik, N.V. Tarlavin, A.V. Dubrovin, N.I. Novikova, V.N. Bolshakov, E.S. Ponomareva
Under intensified cattle breeding, combined stress factors, in particular, extremely high milk productivity, inconsistency of neuro-humoral and hormonal regulation of feed intake and milk production, negative energy balance, feeds excessive in starch negatively impact the rumen microbiota and, consequently, a cow’s physiology. This paper for the first time shows the phases of dairy cow lactation cycle as an important factor that determines the relative abundance of non-attributable bacteria from the candidate families vadinBE97 and WCHB1-41 which functions are practically not studied. The most pronounced changes in the metabolic potential of the microbiota, namely the inhibition of various metabolic pathways in the rumen chyme, e.g., energy (tricarboxylic acid cycle), protein, carbohydrate, lipid, including volatile fatty acid (VFA) synthesis, occurred in cows during stable and declining milk production phases as compared to dry, fresh and milked cows. The aim of this work is to study the composition and metabolic potential of the rumen microbiome in dairy cows during different physiological phases. The experiment (the JSC Agrofirma Dmitrova Gora, Tver Province, the summer 2020) was performed on 15 black-and-white Holsteinized dairy cows (Bos taurus) of the second and third lactations. The cows were assigned to five groups (5 cows each), including the dry cows (on average 30 days before calving, group I), the cows of 20 milking days (group II), of 90 milking days (group III), at day 208 of lactation (group IV), and in late lactation phase when the milk production is declining (day 310, group V). Dairy cows’ diets were calculated using AMTS.Cattle.Professional software in accordance with the accepted requirements. Total DNA was extracted from rumen chyme samples (a Genomic DNA Purification Kit, Fermentas, Inc., Lithuania). The NGS procedure (a MiSeq platform, Illumina, Inc., USA) was performed using primers to the 16S rRNA V3-V4 region and reagents for NGS library preparation (Nextera® XT IndexKit, Illumina Inc., USA), PCR product purification (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter Inc., USA), and sequencing (MiSeq® ReagentKit v2, 500 cycle, Illumina Inc., USA). Bioinformatic analysis was performed with Qiime2 ver. 2020.8 software. Noise sequences were filtered by the Deblur method. The de novo phylogeny was constructed using the MAFFT software package. To analyze the taxonomy, the reference database Silva 138 (https://www.arb-silva.de/documentation/release-138/) was used. Reconstruction and prediction of the functional content of the metagenome was performed using PICRUSt2 software package v.2.3.0 with MetaCyc database for metabolic pathways and enzymes. Total RNA was isolated from the chyme samples (Aurum Total RNA kit, Bio-Rad, United States) followed by cDNA synthesis (iScript RT Supermix kit, BioRad, USA). The relative expression of the bacterial L-lactate dehydrogenasegene Ldh-L and the Ldb 0813 gene associated with D-lactate dehydrogenase synthesis was assessed using quantitative PCR (SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix kit, Bio-Rad, USA). The16S metagenomic sequencing revealed a decrease (p ≤ 0.05) in the rumen bacteria a-diversity in group IV and group V. We have found twelve superphila and phyla of microorganisms. The superphylum Bacteroidota and the phylum Firmicutes we refer to the dominant rumen bacteria (up to 59.94±1.86 and 46.82±14.40 % of the population, respectively). The superphylum Actinobacteriota bacteria not found in lactating cows appeared only in dry cows. The bacteria of the superphylum Armatimonadota disappeared from the rumen of fresh cows and during stable lactation phase, and of the phylum Chloroflexi — during early and stable lactation phases. The cows differed significantly in eight bacterial families, the Muribaculaceae, Prevotellaceae, Erysipelatoclostridiaceae, Oscillospiraceae, Ruminococcaceae, Saccharimonadaceae, and candidate families WCHB1-41 and vadinBE97. The rumen genera Asteroleplasma, Sharpea, Moryella, Oribacterium, Shuttleworthia appeared after calving and persisted in the next phases of lactation. These bacteria were absent in dry cows. The predicted functional capability of 17 metabolic pathways of the microbiome varied (p ≤ 0.01) in cows of different groups. The most pronounced changes, namely the suppression of various metabolic pathways in the rumen chyme, occurred in groups IV and V compared to group I, group II, and group III (p ≤ 0.01). An increase in the expression of the Ldh-L (p ≤ 0.01) and Ldb 0813 (p ≤ 0.05) genes associated with the synthesis of lactate dehydrogenases was characteristic of fresh cows compared to dry cows. There was a significant increase in the expression of the rumen bacteria genes Ldh-L (10.6-fold, p ≤ 0.001) and Ldb 0813 (2.8-fold, p ≤ 0.05) when lactation declined as compared to group IV.
Keywords: rumen microbiome, ruminants, dairy cows, diet, starch, cellular tissue, NGS- sequencing, PICRUSt2, MetaCyс, metabolic pathway.
ООО «БИОТРОФ+», |
Поступила в редакцию |
