Сельскохозяйственная биология, 2018, том 53, № 4, с. 860-867.
(для цитирования)

doi: 10.15389/agrobiology.2018.4.860rus

УДК 636.4:619:578:[577.2.08+51-76

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОСТИ, ИММУНОГЕННОСТИ И
ПРОТЕКТИВНОСТИ ДНК-КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ
ФРАГМЕНТЫ ГЕНОВ CP204L, E183L И EP402R ВИРУСА
АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

А.Р. ИМАТДИНОВ, О.А. ДУБРОВСКАЯ, Д.Ю. МОРОЗОВА,
В.М. ЛЫСКА, А.Д. СЕРЕДА

Африканская чума свиней (АЧС, ASF) — вирусная контагиозная септическая болезнь, поражающая диких и домашних свиней всех пород и возрастов. У домашних свиней и диких европейских кабанов отмечают сверхострое или острое течение заболевания с лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и смертностью до 100 %. В эндемичных регионах (некоторые страны Восточной Африки) описана подострая форма болезни со смертностью от 30 до 70 %, а также хроническая — с очень низкой смертностью (S. Blome с соавт., 2013; C. Gabriel с соавт., 2011; J.M. Sánchez-Vizcaíno с соавт., 2015). Против АЧС вакцин нет. Исследования по разработке живых, инактивированных, субъединичных вакцин пока не принесли желаемых результатов (P.J. Sánchez-Cordón с соавт., 2017; V. O’Donnell с соавт., 2016; S. Blome с соавт., 2014). В ряде лабораторий мира в качестве перспективы рассматривается возможность получения ДНК-вакцины на основе генов потенциально протективных белков вируса АЧС (ASFV) — р30, р54 и CD2v. Белки р30 и р54 функционально важны в прикреплении ASFV к клетке-мишени. Антитела к р54 блокируют связывание вириона с макрофагом, тогда как антитела к р30 ингибируют проникновение вириона в клетку. CD2v обусловливает гемадсорбирующие свойства вируса (S.D. Kol-lnberger с соавт., 2002; M.G. Barderas с соавт., 2001; J.G. Neilan с соавт., 2004). В своем исследовании мы оценили антигенные, иммуногенные и протективные свойства продуктов трансляции рекомбинантных плазмид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 и pCI-neo/ASFV/CD2v при индукции в адгезивных клетках (А-клетках) аутологичных первичных культур лейкоцитов крови свиней (ЛС). Антигенную активность рекомбинантных белков, продуцируемых используемыми ДНК-конструкциями, определяли методом прямой иммунофлуоресценции в культурах клеток HEK-293T и ЛС. Максимум экспрессии антигенно активных продуктов трансляции в клетках HEK-293T и ЛС, трансфицированных pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v, наблюдали на 2-3-и сут. Особенность схемы иммунизации состояла в том, что свиней трижды (с интервалом 14 сут) иммунизировали А-клетками аутологичной культуры ЛС, трансфицированными in vitro рекомбинантными плазмидными ДНК-конструкциями. Для этого от свиней №№ 1-4 получали по 90 см³ культуры клеток ЛС. На 2-е сут культивирования в них вносили по 90 мкг pCI-neo/ASFV/p30 (№ 1), pCI-neo/ASFV/p54 (№ 2) или pCI-neo/ASFV/CD2v (№ 3). От свиньи № 4 90 см³ культуры ЛС делили на три части по 30 см³ и трансфицировали каждую одной из трех конструкций (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v), внося по 30 мкг плазмидной ДНК. Через 2 сут свиньям №№ 1-4 вводили в центральную ушную вену около 107 аутологичных трансфицированных А-клеток культур ЛС. Методами непрямого твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга мы не обнаружили антител к белкам ASFV в крови иммунизированных животных на 14-е, 28-е и 42-е сут. На 42-е сут после заражения свиней ASFV штамма Мозамбик 78 в область шеи в дозе 10² ГАЕ50 четыре иммунизированные свиньи (№№ 1-4) пали на 6-8-е сут, а контрольная (№ 5, не иммунизирована) — на 13-е сут. Таким образом, иммунизация аутологичными антигенно активными А-клетками ЛС, трансфицированными рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v, не индуцировала выработку вирусоспецифических антител и защиту от контрольного заражения.

Ключевые слова: африканская чума свиней, ASFV, рекомбинантные плазмиды, белки ASFV р30, р54 и CD2v, антигенность, иммуногенность.

Полный текст

THE STUDY OF ANTIGENICITY, IMMUNOGENICITY AND PROTECTIVE POTENTIAL OF DNA CONSTRUCTS CONTAINING FRAGMENTS OF GENES CP204L, E183L OR EP402R OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS STRAIN MK-200

A.R. Imatdinov, O.A. Dubrovskaya, D.Yu. Morozova, V.M. Lyska,
A.D. Sereda

African swine fever (ASF) is a viral, contagious and septic disease affecting wild and domestic pigs of all breeds and age groups. In both domestic pigs and wild European boars affected, some hyperacute or acute forms of the infection are observed which are characterized by fever, signs of toxicosis, hemorrhagic diathesis with mortality rates of up to 100 %. In endemic regions (e.g., some countries of East Africa), a subacute form of the disease with a mortality of 30 to 70 %, as well as a chronic one with very low mortality levels are reported (S. Blome et al., 2013; C. Gabriel et al., 2011; JM Sánchez -Vizcaíno et al., 2015). No vaccine against African swine fever is currently available, and the research works aimed at the development of live, inactivated and subunit vaccines have not achieved the intended result yet (P.J. Sánchez-Cordón et al., 2017; V. O’Donnell et al., 2016; S. Blome et al., 2014). Nevertheless, the opportunity of obtaining a DNA vaccine using the genes of potentially protective ASFV proteins p30, p54 and/or CD2v is considered to be a promising option in a number of laboratories worldwide. The proteins p30 and p54 are functionally important in attaching the ASF virus to the target cell. The antibody to p54 blocks the virion binding to the macrophage, whereas the antibody to p30 inhibits the virion penetration into the cell. The protein CD2v determines the hemadsorbing properties of the virus (S.D. Kollnberger et al., 2002; M.G. Barderas et al., 2001; J.G. Neilan et al., 2004). This work has been performed to study effects of the translation products of recombinant plasmids pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 and pCI-neo/ASFV/CD2v induced in adhesive cells (A-cells) after transfection. The antigenic activity of the recombinant proteins produced with these DNA constructs was compared in permanent cell line HEK-293T and swine leukocyte (SL) autologous primary cultures using a direct fluorescence technique. The highest expression of the antigen-active translation products in HEK-293T and SL cells transfected with pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 or pCI-neo/ASFV/CD2v was observed on day 2. The peculiarity of the pig immunization schedule applied was that the animals were thrice immunized at a 14-day interval with autologous LS A cells transfected in vitro with the above recombinant plasmids. For this, as much as 90 cm³ of LC cell culture was produced using blood samples from each of the animals No.No. 1-4. On day 2 of the culturing, 90 μg of pCI-neo/ASFV/p30 (No. 1), pCI-neo/ASFV/p54 (No. 2) or pCI-neo/ASFV/CD2v (No. 3) was added thereto. The LS culture obtained from the pig No. 4 in a volume of 90 cm³ was divided into three portions of 30 cm³, and each one was transfected with one of the three constructs (i.e., pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 or pCI-neo/ASFV/CD2v) by adding 30 μg of the plasmid DNA. Two days later, the pigs No. 1 to No. 4 were inoculated into the central auricular vein with about 107 autologous transfected A-cells of LS cultures. On days 14, 28 and 42, no antibody against ASFV proteins was detected in the blood of the immunized pigs using indirect solid-phase ELISA and immunoblotting. After the pigs were infected into the neck with 10² HAU50 of an ASFV strain Mozambique-78 on day 42, the four pre-immunized pigs (No.No. 1-4) died on day 6 to 8 and the control one died (No. 5) on day 13. Thus, the immunization of pigs with the autologous and antigenically active LS cells transfected with the recombinant plasmids pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 or pCI-neo/ASFV/CD2v failed to provide antibody response or protection against the challenge.

Keywords: African swine fever, ASFV, recombinant plasmids, ASFV proteins р30, р54 and CD2v, antigenicity, immunogenicity.