doi: 10.15389/agrobiology.2017.4.776rus

УДК 636.2:591.39

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда
(проект 16-16-10069).

 

СПОСОБНОСТЬ ООЦИТОВ КОРОВ К ЭМБРИОНАЛЬНОМУ
РАЗВИТИЮ ПРИ СОЗРЕВАНИИ В РАЗНЫХ СИСТЕМАХ
ДВУХФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Г.Н. СИНГИНА, И.Ю. ЛЕБЕДЕВА, Е.Н. ШЕДОВА,
Т.Е. TAPAДАЙНИК, О.С. МИТЯШОВА, Е.В. ЦЫНДРИНА,
С.С. ДАНЧ

Существующие подходы к двухфазному способу культивирования ооцитов крупного рогатого скота (КРС) не учитывают их специфические потребности в период созревания от метафазы I до метафазы II, в том числе необходимость нормализации профилей половых стероидных гормонов в культуральной среде. Целью представленного исследования было сравнение компетенции к развитию у ооцитов коров (Bos taurus taurus), созревших в общепринятой однофазной и различных двухфазных системах. Нами впервые изучена способность яйцеклеток развиваться до стадии бластоцисты и качество полученных эмбрионов при замене стандартной среды на втором этапе культивирования на среду, свободную от фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), а также на культуру клеток гранулезы. При использовании однофазной системы ооцит-кумулю-сные комплексы (ОКК) культивировали в течение 24 ч в среде ТС-199, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 10 мкг/мл ФСГ и 10 мкг/мл лютеинизирующего гормона (ЛГ). В двухфазной системе ооциты созревали в тех же условиях в течение первых 12 ч. Затем ОКК пересаживали в новую среду (ТС-199, содержащую 10 % ФБС, или эту же среду, дополненную 5 мкг/мл ЛГ) и культивировали 12 ч в присутствии и в отсутствие клеток гранулезы. Через 24 ч созревания проводили оплодотворение ооцитов. В эмбрионах, развившихся до стадий поздней морулы и бластоцисты на 7-е сут культивирования, оценивали степень апоптоза (методом TUNEL) и общее число ядер (окраска DAPI). В средах, собранных после созревания ооцитов, определяли содержание прогестерона и 17β-эстрадиола методом иммуноферментного анализа. Доля ооцитов, вступивших в первое деление дробления (57,6-68,1 %) или развившихся до стадий поздней морулы/бластоцисты (16,7-20,7 %), не была связана со способом или средой культивирования. Перенос ооцитов через 12 ч созревания в среду, лишенную гонадотропных гормонов, приводил к увеличению общего числа ядер в поздних морулах/бластоцистах в 1,3-1,4 раза (p < 0,05) и в отсутствие, и в присутствии клеток гранулезы, тогда как это число снижалось до значений в однофазном контроле при добавлении ЛГ. В то же время доля апоптотических ядер (2,3-6,9 %) не зависела от системы дозревания ооцитов или воздействия ЛГ. В двухфазной системе содержание 17β-эстрадиола в среде созревания (с ЛГ и без него) было в 1,3-1,4 раза меньше (p < 0,01), чем в однофазной. Напротив, совместное культивирование ОКК с клетками гранулезы приводило к повышению концентрации 17β-эстрадиола в культуральной среде, содержащей ЛГ (с 418±16 до 496±26 пг/мл, p < 0,05). При этом не было обнаружено различий между всеми исследуемыми вариантами по содержанию прогестерона в среде культивирования ОКК. Полученные данные свидетельствуют о том, что двухфазная система созревания ооцитов коров может применяться как альтернатива общепринятому протоколу IVM (in vitro maturation). Перенос ооцитов через 12 ч культивирования в среду без гонадотропных гормонов обусловливает повышение качества полученных поздних морул/бластоцист, а также приводит к нормализации профиля 17β-эстрадиола в культуральной среде на завершающем этапе созревания яйцеклеток.

Ключевые слова: ооциты коров, двухфазная система созревания in vitro, эмбриональное развитие, половые стероидные гормоны.

 

Полный текст

 

 

BOVINE OOCYTE ABILITY TO EMBRYONIC DEVELOPMENT
WHEN MATURING IN DIFFERENT TWO-PHASE CULTURE SYSTEMS

G.N. Singina, I.Yu. Lebedeva, E.N. Shedova, T.E. Taradajnic,
O.S. Mityashova, E.V. Tsyndrina, S.S. Danch

Existing approaches to a two-phase method of culture of cattle oocytes do not take into account their specific demands during maturation from metaphase I to metaphase II including the need for normalization of profiles of sex steroid hormones in a culture medium. The aim of the presented research was to compare the developmental competence of bovine (Bos taurus taurus) oocytes matured in conventional single-phase and different two-phase systems. We have studied for the first time the ovum ability to develop to the blastocyst stage and the quality of embryos produced when replacing the standard medium at the second stage of culture with a medium free of follicle-stimulating hormone (FSH) as well as by a granulosa cell culture. When using the single-phase system, cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 24 h in the medium TCM 199 containing 10 % fetal bovine serum (FBS), 10 µg/ml FSH, and 10 µg/ml luteinizing hormone (LH). In the two-phase system, oocytes matured in the same conditions for first 12 h. Then COCs were transferred to a new medium (TCM 199 containing 10% FBS or the same medium supplemented with 5 µg/ml LH) and cultured for 12 h in the presence or in the absence of granulosa cells. After 24 h of maturation, oocyte fertilization was performed. In embryos that developed to the stages of late morula and blastocyst on day 7 of culture, the degree of apoptosis and the total number of nuclei were assessed (by the TUNEL method and DAPI staining, respectively). In media collected after oocyte maturation, levels of progesterone and 17β-estradiol were determined by enzyme immunoassay. The proportions of oocytes entered the first cleavage division (57.6-68.1 %) or developed to the stages of late morula/blastocyst (16.7-20.7 %) were not associated with the culture method or medium. The transfer of oocytes after 12 h of maturation to the medium free of gonadotropic hormones resulted in 1.3-1.4-fold increase in the total number of nuclei in the late morulae/blastocysts both in the absence and in the presence of granulosa cells, whereas this number decreased to the level of single-phase control on addition of LH. At the same time the proportion of apoptotic nuclei (2.3-6.9 %) did not depend on the system of oocyte maturation or the effect of LH. In the two-phase system, the level of 17β-estradiol in the maturation medium (with and without LH) was 1.3-1.4-fold lower (p < 0.01) as compared to the single-phase system. On the contrary, co-culture of COCs with granulosa cells led to a rise in the concentration of 17β-estradiol in the culture medium containing LH (from 418±16 to 496±26 pg/ml, p < 0.05). Meanwhile, no differences in the progesterone level in the culture medium of COCs of oocytes after 12 h of culture to the medium free of gonadotropic hormones causes an increase in the quality of the late morulae/blastocysts produced as well as leads to normalization of the 17β-estradiol profile in the culture medium at the terminal step of the ovum maturation.

Keywords: bovine oocytes, two-phase system of in vitro maturation, embryonic development, sex steroid hormones.

 

ФГБНУ  Федеральный научный центр животноводства ВИЖ им. академика Л.К.Эрнста,
142132 Россия, Московская обл., г.о. Подольск,
пос. Дубровицы, 60,
e-mail: g_singina@mail.ru, irledv@mail.ru, shedvek@yandex.ru,almaatinka25@rambler.ru, mityashova_o@mail.ru, danch.s.s@mail.ru, vip.krilochkina@mail.ru

Поступила в редакцию
16 мая 2017 года

 

назад в начало