УДК 636.52/.58:573.6.086.83:636.082
doi: 10.15389/agrobiology.2015.4.458rus
Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице ФАНО, номер госрегистрации НИР 01201455101. В проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. Л.К. Эрнста
ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ЭФФЕКТИВНОГО ВВЕДЕНИЯ
ТРАНСГЕНОВ В ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КУР
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛЕНТИВИРУСНОЙ ВЕКТОРНОЙ СИСТЕМЫ
Н.А. ВОЛКОВА1, И.К. ФОМИН1, Е.К. ТОМГОРОВА1, А.Н. ВЕТОХ1,
Э.Р. МЕННИБАЕВА1, Г. БРЕМ2, Н.А. ЗИНОВЬЕВА1
Перенос генов, опосредованный ретровирусными и лентивирусными векторами, рассматривается в качестве одного из перспективных способов генетической модификации сельскохозяйственной птицы (S.C. Chapman et al., 2005; C.A. Smith et al., 2009; Н.А. Волкова с соавт., 2013). Однако эффективность трансгенеза эмбриональных клеток кур рекомбинантными ретровирусами и лентивирусами лимитируется рядом факторов. Одной из проблем при получении трансгенной птицы остается наличие большого числа эмбриональных клеток (порядка 60000-100000) на начальном этапе инкубации и необходимость применять высококонцентрированные вирусные препараты (около 109 вирусных частиц/мл) для достижения относительно приемлемой эффективности введения трансгенов. Целью настоящей работы стало получение вектора на основе модифицированной лентивирусной системы второго поколения и определение оптимальных условий использования лентивирусных векторов для трансгенеза эмбрионов кур. В состав векторной системы входили три различные плазмиды: psPAX2, содержащая гены gag-pol; pLPG, кодирующая поверхностный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (VVS-G), и pWPXL — самоинактивирующийся лентивирусный вектор, несущий ген eGFP (enhanced green fluorescence protein) под контролем промотора гена фактора элонгации 1 РНК-полимеразы II человека (hEF1a). Для получения рекомбинантного вируса и определения титров использовали линию клеток человека 293T. Введение вирусного препарата в куриные эмбрионы проводили в разные сроки после начала инкубации: через 20-24 ч (I группа) и через 50-55 ч (II группа). Эффективность трансформации и число интегрированных копий трансгена оценивали методом real-time PCR (RT-PCR) анализа ДНК, выделенной из эмбрионов на 7-е сут инкубации, на наличие eGFP. Максимальные титры вирусных препаратов были получены при количественном соотношении плазмид psPAX2, pLPG и pWCAG 1:1:3 и составили 2,4×107 КОЕ/мл до ультрацентрифугирования и 6,2×108 КОЕ/мл — после концентрирования ультрацентрифугированием. Представленные данные показывают, что изменение соотношения между компонентами векторной системы по сравнению со стандартной схемой позволяет значительно увеличить титр получаемого вирусного препарата. Биологические титры вирусных препаратов порядка 108 КОЕ/мл достаточны для инфицирования до 78 % клеток на ранних этапах развития эмбриона. Эффективность генетической трансформации, оцененная по доле трансформированных клеток, в I и II группах эмбрионов составила соответственно 78,0 и 31,0 %. Предположительно на более ранних стадиях клетки эмбриона инфицировались большим количеством вирусных частиц, чем и объясняется разница в числе копий вектора в составе клеточного генома в I и II группах. Исходя из полученных результатов, средняя эффективность переноса генов с помощью лентивирусных векторов находилась в пределах 30,0-34,3 % и слабо варьировала при изменении времени введения после начала инкубации эмбрионов. Этот факт указывает на то, что только часть клеток эмбриона обычно доступна для инфицирования вирусом. Инфицирование эмбрионов в разные сроки при использовании вирусных препаратов с одинаковыми титрами позволяет получать популяции эмбриональных клеток с неодинаковым числом копий вектора в составе клеточного генома. Таким образом, эффективность переноса генов в эмбрионы кур с использованием лентивирусных векторов не зависит от стадии развития эмбриона в течение по крайней мере первых 55 ч инкубации и может быть прогнозируемой.
Ключевые слова: лентивирусные векторы, молекулярное клонирование, трансфекция, трансгенные животные.
N.A. Volkova1, I.K. Fomin1, E.K. Tomgorova1, A.N. Vetokh1,
E.R. Mennibaeva1,
G. Brem2, N.A. Zinovieva1
Lentivirus-mediated gene transfer is being the one of the attractive method for genetic modification of chicken (S.C. Chapman et al., 2005; C.A. Smith et al., 2009; N.A. Volkova et al., 2013). However, the efficiency of thansgenesis of the chicken embryonic cells has been shown to be relatively low. Therefore, a large number (60,000 to 100,000) of embryonic cells at the start of incubation and the virus preparations with high titers (about 109 particles per milliliter) remain one of a crucial problem the researchers are facing with when try to achieve a satisfactory transgene introduction. The aim of the present study was to determine the optimal conditions for production and application of the modified lentiviral vector system of second generation for the transgenesis of chicken embryos. The vector system consisted of three different plasmids: psPAX2, containing gag-pol genes; pLPG, coding envelop glycoprotein G of vesicular stomatitis virus (VVC-G) and pWPXL, the self-inactivated lentiviral vector, carrying eGFP (enhanced green fluorescence protein) gene under control of promoter region of the human elongation factor 1 alpha-encoding gene. To produce the recombinant virus particles and to determine the virus titers we used human cell line 293T. The injections of the virus preparations into the chicken embryos were performed at the different stages: from 20 to 24 hours (group 1) and from 50 to 55 hours (group 2) of incubation. To detect the transgenesis efficiency and the number of the integrated copies of the transgene the total DNA was extracted from embryos on the day 7 of incubation and analyzed for the presence of specific eGFP sequences by real-time PCR. The maximal titers of the virus preparations were produced by the ratio of the psPAX2, pLPG and pWCAG plasmids equal 1:1:3 and were 2.4×107 CFU/ml before ultracentrifugation and 6.2×108 CFU/ml after concentration by ultracentrifugation. The efficiency of genetic transformation which was evaluated as the part of the transformed cells from the overall number of analyzed cells was 78.0 and 31.0 % in the groups 1 and 2, respectively. It was shown, that the alteration in the ratios between components of the vector system comparing to the standard scheme allows significantly increase the titers of the produced virus preparations. The biological titers of the virus preparations of 108 CFU/ml are sufficient to infect up to eighty percent of cells at the earlier stages of embryo development. Presumably, at earlier embryogenesis the cells were infected with more viral particles resulting in different number of the transgene copies integrated into cell genome in the groups 1 and 2. From the obtained results, the efficiency of transgenesis by means of the lentiviral vectors ranged from 30.0 to 34.3 % and varied slightly depending on time after the embryos incubation began. These results indicate that only a part of embryonic cells is usually available for viral infection. Injection of embryos at different intervals of incubation by viral preparations with similar titers produced the populations of embryonic cells with different amounts of vector copies in the cell genome. So the efficiency of hen embryo thransgenesis does not depend on the stage of its development at least for 55 hours of the embryogenesis and can be predictable.
Keywords: lentiviral vectors, molecular cloning, transfection, transgenic animals.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ животноводства
|
Потупила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
