Сельскохозяйственная биология, 2011, № 4, с. 90-95.

УДК 635.65:631.5:631.46

ПРИМЕНЕНИЕ СМЕШАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

В.П. ШАБАЕВ

В микрополевых и вегетационных опытах изучали влияние комбинированной инокуляции различными культурами клубеньковых бактерий и ризосферными ростстимулирующими бактериями рода Pseudomonas на урожай зерна гороха и сои и зеленой массы люцерны и клевера. Показано, что внесение смешанных бактериальных культур усиливает симбиотическую азотфиксацию, увеличивает количество биологического азота в растениях и вынос макро- и микроэлементов из почвы с урожаем. Эффективность комбинированной инокуляции бактериями зависит от внесения азотного и фосфорного удобрения.

Ключевые слова: бобовые, клубеньковые бактерии, Pseudomonas, урожай, вынос питательных элементов, азотфиксация, NPK-удобрения.

В последние десятилетия для стимуляции роста и повышения урожаев сельскохозяйственных растений, в том числе бобовых, применяют смешанные культуры микроорганизмов, обладающие более высокой азотфиксирующей активностью, устойчивостью во внешней среде и конкурентоспособностью по отношению к естественной микрофлоре (1, 2).
Ранее мы установили, что бактерии Pseudomonas fluorescens 20 и P. flu-orescens 21 колонизировали корневую систему и выживали в ризоплане как бобовых (соя) (3), так и небобовых растений (озимая пшеница и кормовая свекла) (5, 8). Бактерия P. fluorescens 20 стимулировала рост и повышала урожай зерновых (5, 6), корнеплодов (7-9) и ярового рапса (10).
Цель настоящей работы — изучить влияние инокуляции клубеньковыми бактериями в сочетании с ризосферными ростстимулирующими бактериями рода Pseudomonas на продуктивность и симбиотическую азотфиксацию у различных видов бобовых.
Методика. Объектом исследований, выполненных в 1997-2006 годах, были растения гороха, сои, люцерны и клевера (соответственно сорта Смарагд, Магева, Славянская местная и ВИК 1).
Микрополевые опыты проводили в условиях юга Московской области, используя сосуды без дна (0,33Í0,33Í0,33 м; 0,1 м2), вкопанные в верхний слой почвы (почва — серая лесная, 30 кг). В сосудах выращивали по 11 растений каждой культуры.
При посеве в первом варианте опыта семена помещали на поверхность почвы и инокулировали водными суспензиями клубеньковых бактерий (106-107 клеток на растение): горох — Rhizobium lеguтinоsarumbv. viceae 250а, сою — Bradyrhizobiumjaponicum110, люцерну — R. melilotiВКМВ117, клевер — R. trifolii 348а. Штаммы клубеньковых бактерий R. lеguтinоsarumbv. viceae 250а и R. trifolii 348а получены из Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург—Пушкин), B. japonicum110 — из Института биохимии и физиологии микроорганизмов (г. Пущино, Московская обл.), R. meliloti ВКМВ117 — из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Москва). Во втором варианте семена каждого растения инокулировали клубеньковыми бактериями совместно с псевдомонадами (Р. fluorescens 20 или Р. fluorescens 21, выделены из ризосферы овса) в соотношении 5:1, которое, как мы показали ранее, было наиболее эффективным (3, 4). Кроме того, в опыте с соей был также вариант без инокуляции (с использованием автоклавированных бактериальных культур), с горохом — в качестве не фиксирующего азот контроля в одной серии эксперимента в тех же условиях выращивали растения овса сорта Гамбо без инокуляции (с внесением автоклавированных клеток) и с инокуляцией штаммом Р. fluorescens 20.
Во всех экспериментах в почву перед посевом вносили азотное удобрение (аммиачная селитра) в дозе 0,4 г N/сосуд (из расчета 4 г N/м²) на фоне фосфорно-калийных удобрений (однозамещенный фосфорнокислый калий и сернокислый калий) в дозах по 0,8 г д.в./сосуд (из расчета по 8 г д.в./м²), за исключением 2-го опыта с клевером, когда в почву вносили только фосфорное и калийное удобрения. В экспериментах с соей и горохом во всех вариантах использовали меченные 15N азотные удобрения, чтобы оценить соотношение симбиотически фиксированного и минерального азота в питании растений.
Растения гороха и сои выращивали до полной спелости, люцерну и клевер — в течение двух вегетационных периодов (за 1-й год в фазу цветения растений было проведено три укоса люцерны и один укос клевера, за 2-й — по два укоса обеих культур).
Долю фиксированного азота атмосферы и минерального азота для растений гороха устанавливали методом сравнения с небобовой культурой (овсом), для растений сои — методом сравнения с неинокулированным контролем (11). В растениях определяли содержание азота и зольных элементов (5-10). Кроме того, для гороха, сои и овса оценивали изотопный состав азота (избыток ат. % 15N) (3, 6, 8). Повторность опытов 4-кратная.
В вегетационном эксперименте три растения сои выращивали до фазы начала образования бобов (в течение 85 сут) в сосудах диаметром 9 см и высотой 30 см, заполненных смесью серой лесной почвы и песка (1:1 по объему), в которые вносили фосфорное удобрение (однозамещенный фосфорнокислый калий из расчета 0; 5 и 20 мг P₂O₅) на фоне азотно-калийных удобрений (сульфат аммония и сернокислый калий, соответственно 4 мг N и 20 мг K₂O на 100 г субстрата). В одной серии опыта семена при посеве инокулировали чистой культурой клубеньковых бактерий B. japonicum110, в другой использовали смешанную культуру — бактерии B. japonicum 110 и P. fluorescens 21. Оценивали влияние бактерии P. fluorescens 21 на массу растений, формирование корневых клубеньков и их азотфиксирующую активность, которую определяли ацетиленовым методом (1). Повторность опыта 5-кратная.
Данные по урожаю и результаты химических анализов растений повергали статистической обработке методом дисперсионного анализа с применением пакета программ Statgrafics.
Результаты. Обработка семян смешанными бактериальными инокулятами привела к значительному повышению урожая у бобовых растений (табл. 1). Внесение клубеньковых бактерий R. lеguтinоsarum bv. viceae 250а совместно с P. fluorescens 20 увеличило массу зерна гороха почти на 20 % по сравнению с вариантом, когда использовалась чистая культура клубеньковых бактерий. Инокуляция B. japonicum 110 совместно с бактериями рода Pseudomoпas оказала положительное влияние на рост растений сои даже на фоне высокой эффективности применения только клубеньковых бактерий, которое сопровождалось увеличением урожая зерна более чем в 2 раза (высокая отзывчивость обусловлена отсутствием этих ризобий в серой лесной почве). При совместной инокуляции сои клубеньковыми бактериями и P. fluorescens 20 либо P. fluorescens 21 прибавки массы зерна продолжали возрастать и составили 18-21 % по сравнению с показателем при внесении только B. japonicum110.
Положительный эффект от применения смешанных бактериальных культур обнаружили и на бобовых травах (см. табл. 1). В сумме за 2 вегетационных периода при внесении P. fluorescens 20 зеленая масса люцерны возросла на 33 %. Однако для клевера в отличие от других бобовых культур применение обеих смешанных бактериальных культур на фоне азотного удобрения (в составе NPK-удобрений) было неэффективным (1-й микрополевой опыт). Положительный эффект от смешанного инокулята R. trifolii 348а и P. fluorescens 20 проявился только на фоне РК-удобрений (2-й микрополевой опыт). Прибавка зеленой массы у клевера в сумме за 2 года при этом достигала 16 %.

Комбинированная инокуляция клубеньковыми бактериями и псевдомонадами значительно повышала накопление азота бобовыми растениями. Так, внесение P. fluorescens 20 и P. fluorescens 21 увеличило вынос этого элемента с зерном сои на 8-14 %. В сумме за 3 укоса под влиянием бактерии P. fluoresceпs 20 количество азота в зеленой массе люцерны в 1-й вегетационный период возросло в 1,5 раза, в зеленой массе клевера за 2 года опыта — на 26 %.
При комбинированной инокуляции у сои существенно возрастало накопление в зерне практически всех исследованных зольных элементов — для некоторых повышение выноса достигало 50 % (табл. 2). Исключение составил Сo в варианте с P. fluorescens 21: вынос этого элемента с зерном остался без изменения. При внесении клубеньковых бактерий совместно с бактерией P. fluorescens 20 у растений люцерны в 1-й вегетационный сезон наблюдали увеличение выноса с зеленой массой P, Ca, Zn, Cu и Mo в 1,5-1,7 раза, K, Mg, Fe и Co — в 1,3-1,4 раза. Во 2-м опыте в варианте со смешанной бактериальной культурой R. trifolii 348а и P. fluorescens 20 на фоне применения РК-удобрений в зеленой массе клевера также отмечали рост количества зольных элементов. По сумме за 2 года он составил от 14 до 30 %, причем по выносу K, Zn и Mo с урожаем повышение оказалось наиболее значительным (отметим, однако, что количество Cu при этом не изменялось). Следовательно, внесение бактерий рода Pseudomonas в почву улучшало минеральное питание бобовых культур.

Необходимо отметить, что наблюдаемое повышение выноса питательных элементов у бобовых происходило вследствие увеличения урожая (без существенных изменений содержания большинства элементов в растениях). Известно, что химические элементы оказывают на растения как прямое действие, входя в активные центры ферментов, так и косвенное действие, изменяя метаболитические процессы. Улучшение минерального питания, несомненно, сказывается на активизации физиологических процессов в растении. В частности, установлено усиление фотосинтеза (интенсивности газообмена СО₂) у сои при инокуляции псевдомонадами (3). Увеличение выноса элементов минерального питания из почвы свидетельствует о повышении их доступности для растений при инокуляции бактериями рода Pseudomonas. Это, в частности, отмечается для Mo, который входит в состав азотфиксирующего фермента — нитрогеназы, а также для других элементов, участвующих в микробиологической фиксации молекулярного азота.
В опытах с горохом и соей применение азотных удобрений, меченных стабильным изотопом ¹⁵N, в стартовых дозах позволило установить соотношение симбиотрофного и минерального азота в питании бобовых растений (табл. 3). При внесении P. fluorescens 20 было выявлено увеличение количества симбиотически фиксированного азота атмосферы (или биологического азота) в зерне гороха в 1,5 раза, азота удобрения и почвы — соответственно на 14 и 18 %. Инокуляция сои клубеньковыми бактериями сов-местно с псевдомонадами повышала количество фиксированного азота в урожае на 9-13 % и усиливала потребление растениями азота из почвы на 14-29 %, меченого минерального азота — на 8-15 %.

В вегетационном опыте с растениями сои было обнаружено положительное влияние ризосферных псевдомонад на формирование и азотфиксирующую активность бобово-ризобиального симбиоза, которое зависело от уровня фосфорного питания (табл. 4). При недостаточной обеспеченности растений фосфором (0 и 5 мг P2O5/100 г субстрата) бактерия P. fluorescens21 не влияла на массу растений и образование корневых клубеньков, несмотря на значительное усиление их азотфиксирующей активности при внесении первой дозы фосфорного удобрения в минимальной дозе — 5 мг P₂O₅/100 г субстрата. Наиболее значимое улучшение клубенькообразования и увеличение массы растений наблюдали при высокой дозе — 20 мг P₂O₅/100 г субстрата. Необходимо отметить, что на фоне фосфорного удобрения внесение псевдомонады в составе смешанной бактериальной культуры привело к последовательному увеличению зеленой массы растений сои по сравнению с показателем в варианте с чистой культурой клубеньковых бактерий. Вероятно, при этих условиях фосфорного питания положительный эффект обусловлен образованием бактериями рода Pseudomonas дополнительных факторов роста, например фитогормонов (12).
Таким образом, повышение урожаев бобовых растений при комбинированной инокуляции смешанными культурами клубеньковых бактерий и бактерий рода Pseudomonas связано с усилением симбиотической азотфиксации и улучшением минерального питания растений. На эффективность комбинированной инокуляции значительно влияет внесение азотного и фосфорного удобрения.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. У м а р о в  М.М. Ассоциативная азотфиксация. М., 1986.
2. Б е л и м о в  А.А.,  К о ж е м я к о в  А.П. Смешанные культуры азотфиксирующих бактерий и перспективы их использования в земледелии. С.-х. биол., 1992, 5: 77-87. 
3. S h a b a y e v  V.P.,  S m o l i n  V.Yu.,  M u d r i k  V.A. Nitrogen fixation and CO2 exchange in soybeans (Glycine max L.) inoculated with mixed cultures of different microorganisms. Biol. Fertil. Soils, 1996, 23(4): 425-430.
4. Ш а б а е в  В.П. Урожайность и азотное питание растений люцерны при комбинированной инокуляции семян бактериями Rhizobiummeliloti и Pseudomonassyringae pv. tabaci. С.-х. биол., 2006, 3: 67-73. 
5. Ш а б а е в  В.П.,  С м о л и н  В.Ю. Отзывчивость озимой пшеницы на инокуляцию бактериями рода Pseudomonas на серой лесной почве. Почвоведение, 2000, 4: 497-504.
6. Ш а б а е в  В.П. Оптимизация доз минеральных удобрений инокуляцией семян ростстимулирующими ризосферными бактериями при возделывании зерновых культур. Докл. РАСХН, 2004, 6: 24-26.
7. Ш а б а е в  В.П.,  С а ф р и н а  О.С.,  М у д р и к  В.А. Влияние ризосферной бактерии Pseudomonasflиorescens 20 и эндомикоризного гриба Gloтusmosseae на урожай и рост редиса в зависимости от условий минерального питания. Агрохимия, 1998, 6: 34-41.
8. Ш а б а е в  В.П.,  С м о л и н  В.Ю. Отзывчивость кормовой свеклы на инокуляцию бактерией Pseudomonas fluorescens 20 на серой лесной почве при различных условиях минерального питания. Почвоведение, 2002, 6: 715-724.
9. Ш а б а е в  В.П. Отзывчивость растений сахарной свеклы на инокуляцию нефиксирующими азот и азотфиксирующими бактериями рода Pseudomonas на черноземе выщелоченном. С.-х. биол., 2005, 3: 55-59. 
10. Ш а б а е в  В.П.,  С м о л и н  В.Ю. Урожай рапса и вынос элементов минерального питания при инокуляции семян культурой ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens 20 на фоне различных доз азотного удобрения. Агрохимия, 1999, 5: 67-73.
11. F o s h t  D.D.,  P o t h  M. Measurement of biological nitrogen fixation by 15N techniques. In: Symbiotic nitrogen fixation technology /G.N. Elkan (ed.). Marcel Dekker, Inc., N.Y. & Basel, 1987: 257-288.
12. О л ю н и н а  Л.Н.,  Ш а б а е в  В.П. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas. Микробиология, 1996, 5: 813-817.

APPLICATION OF MIXED BACTERIAL CULTURES FOR INCREASING YIELD OF LEGUMINOUS PLANTS

V.P. Shabayev

Combined inoculation with mixed cultures of nodule bacteria, Rhizobiuт lеguтinоsarum bv. viceae 250а, Bradyrhizobiuт japonicum 110, R. meliloti ВКМВ117, R. trifolii 348а, and plant growth-promoting rhizobacteria of the genus Pseudomonas, Р. fluorescens 20 or Р. fluorescens 21, was shown to enhance yield of pea and soybean grain and green mass of alfalfa and clove in microfield and pot experiments in condition of Moscow region. Mixed bacterial cultures stimulate symbiotic N2 fixation and increase the amount of biological N in plants and macro- and micronutrients uptake by yield from the soil. The efficiency of combined inoculation with bacteria depends on application of N and P fertilizers.

Keywords: legumes, nodule bacteria, Pseudomonas, yield, nutrients uptake, N₂-fixation, NPK-fertilizers.

Оформление электронного оттиска