Сельскохозяйственная биология, 2010, № 4, с. 45-50.

УДК 636:[615.371+577.15]:57.08

РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ ПРОИЗВОДСТВА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРТОВ И ФЕРМЕНТОВ

В.М. ПОПОВА, И.И. КОЧИШ, И.Л. БЕРО, А.Я. САМУЙЛЕНКО, А.И. ГУСЛАВСКИЙ

Сравнивали разные способы культивирования клеток и вирусов на подготовительных этапах получения биопрепаратов, а также приемы очистки, разделения, концентрирования, обессоливания и стерилизации биологических растворов. Оптимизирована технология получения трипсина, в производственных условиях проведены испытания его опытных серий.

Ключевые слова: биотехнология, ветеринарные препараты, культивирование клеток, фермент, трипсин, фильтрующие материалы, мембраны, фильтры, фильтрация, микрофильтрация, электродиализ.

В настоящее время на предприятиях биологической промышленности производится 220 видов препаратов, из который 120 — вакцины, 14 — лечебные  сыворотки, 35 — диагностические, 30 — химико-фармацевтические, 21 — другие препараты (1). Механизация основных и вспомогательных процессов при этом составляет чуть больше 50, автоматизация — 10-30 %.

Производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, физико-химических процессов, для осуществления которых используют разнотипное оборудование, связанное между собой материальными, энергетическими потоками и образующее технологические линии (2). Повышение эффективности производства и качества выпускаемой продукции остается одной из основных задач биотехнологии.

Целью настоящей работы было совершенствование производства ветеринарных препаратов и ферментов, в связи с чем мы исследовали технологические параметры различных способов культивирования клеток и вирусов; отрабатывали режимы очистки, разделения, концентрирования, обессоливания и стерилизации биологических растворов; улучшили технологию изготовления трипсина и провели испытание его опытных серий.

Методика. В исследованиях использовали первичные клетки фибробластов эмбрионов перепелов (ФЭП) и кур (ФЭК); перевиваемые линии клеток почек сирийского хомячка (ВНК-21) и теленка (ПТ-80); вирусы болезни Марека (БМ) и инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц; различные питательные среды (199, Игла и среды на основе мышечных гидролизатов), препараты отечественного и зарубежного производства —  трипсин («Difco», Голландия; «Olain», Латвия; Омский биокомбинат; НПО «Синтез», г. Курган; Алма-Атинский биокомбинат, Казахстан); сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) (Омский биокомбинат) и овец (Ставропольская биофабрика); альбумин овец (Ставропольская биофабрика); буферные растворы, разбавители и концентрат разбавителя для противовирусных вакцин, защитные среды (СФГА) (производство Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности — ВНИТИБП, г. Щелково, Московская обл.).

Культивирование клеток и вирусов проводили в роллерах, трубчатом аппарате (0,006 м³) и реакторах (0,005; 0,025; 0,10 и 0,25 м³) (Иркутский НИИхиммаш). Перемешивание суспензий осуществляли различными типами мешалок — трехлопастной с углом поворота лопастей 45° и 90°, а также шестилопастной турбинной. В процессе культивирования регулировали перемешивание, поддерживали рН, определяли еН, рО₂, рСО₂, концентрацию глюкозы, вязкость, мутность, уровень жидкости в аппарате. В работе использовали микроносители типа цитодекс-3 и акрилекс (Россия).

Для предварительной и тонкой очистки, стерилизующей фильтрации используемых биологических жидкостей и растворов (сыворотки, питательные среды, растворы трипсина и т.д.) применяли глубинные фильтры на безасбестовой основе. Фильтры предварительной очистки (ФП) содержали хлопок и диатомит, тонкой очистки (ФТ) — хлопок и окись алюминия, стерилизующей фильтрации (ФС) — хлопок, каолин и окись алюминия или диатомит (разработка Всероссийского НИИ бумажной промышленности, г. Волжск).

Мембранные микрофильтрационные фильтры (Россия, Белоруссия, Эстония; фирма «Pall», Германия-Франция) применяли при тонкой очистке и стерилизующей фильтрации питательных сред, растворов трипсина, разбавителей, защитных сред и т.п. В качестве префильтра к микрофильтрационным мембранам (размер пор при тонкой фильтрации 0,80-0,45 мкм, при стерилизующей — 0,20 мкм) использовали картон на безасбестовой основе (картон фильтрующий для медицинских препаратов и биологических жидкостей — соответственно КФМП и КФБЖ), содержащей целлюлозу, стеклянные и полипропиленовые волокна и сорбенты.

Очистку, концентрирование и разделение биологических жидкостей проводили с помощью ультрафильтрационных ацетатцеллюлозных мембран Владипор (типы УАМ-50, УАМ-100, УАМ-150, УАМ-200, УАМ-300, УАМ-500, г. Владимир), Рипор (сополимер N-винилпирролидона и метилметакрилата, Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург) в виде пластин и полых волокон из ароматического полиамида с пределом задержания 5, 15, 50 и 100 Да. Для обессоливания белковых растворов применяли электродиализные ионнообменные мембраны) (катионитовые МК-40 и анионитовые МА-41) (НИИ пластмасс, г. Москва).

В качестве исходного сырья для получения протеолитического фермента трипсина использовали поджелудочную железу крупного рогатого скота (ПЖ КРС). Экстрагирование и высаливание фермента осуществляли в модифицированных химических реакторах объемом 450, 630, 1000 л, снабженных мешалкой. Шнековые центрифуги вертикального и горизонтального типа (Россия) применяли для разделения жидкой и твердой фазы после экстракции. Осадительно-фильтрующие центрифуги ОФСст со сменными фильтрующими элементами (ВНИТИБП, г. Щелково, Московская обл.) обеспечивали отделение твердой и жидкой фазы после стадий экстрагирования и высаливания. Для выделения балластных веществ и фермента использовали также суперцентрифугу или саморазгружающиеся и камерные сепараторы (Россия). Высушивание препарата проводили распылительным, сублимационным и калориферным методами.

Результаты. К у л ь т и в и р о в а н и е  к л е т о к  и  в и р у с о в. Роллерный монослойный способ культивирования зарекомендовал себя при получении первичных культур клеток в производстве вирусных вакцин против БМ и ИББ (3, 4). Эффективность монослойного культивирования повышали за счет применения трубчатого аппарата, который имел увеличенное отношение ростовой поверхности к объему. Выращивали различные типы клеток, в том числе перевиваемые линии (ПЛК). Культивирование осуществляли посредством вращения культурального сосуда в горизонтальном или вертикальном положении с постоянной перфузией среды. Для многотрубчатого культиватора была разработана технологическая обвязка с системами подачи стерильного воздуха, термостатирования и очистки отработанных газов через титановые фильтры.

С целью получения первичных культур клеток в суспензии отрабатывали способ псевдосуспензионного культивирования на микроносителях. Наилучшее равномерное перемешивание микроносителя обеспечивало при-менение трехлопастной мешалки с углом поворота лопастей α = 90°. Прием также эффективен для выращивания перевиваемых клеточных культур.

Для отработки технологии суспензионного культивирование перевиваемых клеток ПТ-80 и клеток ВНК-21/13 использовали малообъемный биореактор (0,005 м³). Доля мертвых клеток ПТ-80 при скорости перемешивания 40 об/мин составляла 42 %, 60 и 80 об/мин — соответственно 32 и 28 %. При культивировании клеток ВНК-21/13 перемешивание осуществляли трехлопастной мешалкой с углом поворота a = 90° при скорости вращения 220-300 об/мин, исключающей оседание клеток в питательной среде (среда Игла + среда 199 с добавлением 10 % сыворотки КРС).

Рис. 1. Динамика содержания живых (А) и доли мертвых клеток (Б) ВНК-21/13 при автоматической подаче газовой смеси через клапан (суспенизионное культивирование).

Исходная плотность суспензии в варианте ВНК-21/13 составляла 100 000 кл/мл; наибольшая клеточная масса достигалась после 67 ч культивирования, при этом доля мертвых клеток была равна 2 %, а индекс пролиферации составил 4,5. Подача газовой смеси при поверхностной аэ-рации с применением автоматического клапана способствовала минимизации числа мертвых клеток ВНК-21/13 в течение 40 ч культивирования (рис. 1). При использовании мышечного гидролизата в качестве питательной среды для культивирования клеток ВНК-21/13 исходная плотность суспензии составляла 60 000 кл/мл, индекс пролиферации после 67 ч — 7,4.

Применение объемно-доливного способа (периодическое добавление свежей питательной среды в биореактор) позволило увеличить продолжительность непрерывного культивирования и получить необходимую клеточную массу для дальнейшего использования в реакторах большего объема и при производстве вирусных препаратов.

Проведенные исследования послужили основой для разработки технологического регламента «Культивирование клеток и вирусов с использованием экспериментальных образцов оборудования» и технологической схемы процесса культивирования. Были разработаны технологические схемы к каждому из использованных аппаратов (0,005; 0,025; 0,10 и 0,25 м³), проведен монтаж технологической обвязки к биореакторам, включающей линии очистки и стерилизации воздуха и газовой смеси (воздух + СО₂), обезвреживания отработанных газов, загрузки питательной среды и посевной культуральной жидкости, выгрузки культуральной жидкости, отбора проб, системы термостатирования.

Рис. 2. Пропускная способность безасбестовых фильтр-пластин (предварительная, тонкая и стерилизующая фильтрация) для воды (а) и сыворотки крупного рогатого скота (б): ФП, ФТ, ФС — пластины размером 200x200 мм; ФП-1, ФТ-1, ФС-1 — пластины размером 300x300 мм.

 Ф и л ь т р а ц и я. Использование безасбестовых фильтрующих материалов для очистки и стерилизации питательных сред, растворов и биологических жидкостей позволило избежать мигрирования частиц асбеста в фильтрат. В процессе очистки воды пропускная способность ФП возрастала в начале и стабилизировалась после прохождения 1000 мл, при филь-трации 0,25 % раствора трипсина она падала (рис. 2). При тонкой очистке через пластины ФТ скорость прохождения постепенно росла для воды и в меньшей степени — для раствора трипсина. Пропускная способность пластин ФС для воды и раствора трипсина была одинаковой. Электропроводность воды и раствора трипсина снижалась при прохождении через ФП пластины и не менялась после ФТ и ФС.

Изменение рН воды наблюдали только при фильтрации через ФП пластины, значение рН раствора трипсина в этом случае сначала падало, затем уменьшалось незначительно. В процессе тонкой очистки рН росло, через некоторое время падало, а после прохождения 1000 мл практически не изменялось. При стерильной фильтрации через ФС пластины значение  рН раствора трипсина оставалось неизменным.

Сравнительные испытания показали, что при стерилизующей фильтрации 50 л питательной среды 199 (р = 0,05 МПа) совместное применение микропористых мембран 0,80 мкм + 0,20 мкм «Pall» (Германия-Франция) было наиболее эффективным. Далее следовали комплекты, в которых использовали мембраны белорусского, эстонского и российского производства. Скорость фильтрации через мембраны 0,80 мкм + 0,20 мкм (двухслойные) и КФБЖ + 0,20 мкм (двухслойные) различалась незначительно.

Удельная производительность мембран при стерилизации питательной среды 199 снижалась, но ее удалось увеличить с помощью префильтрации. Так, в варианте с 3 % глютамином, концентратом лактальбумина и защитной средой СФГА при применении мембран 0,20 мкм с префильтрами КФМП и КФБЖ процесс ускорялся в 4-5 раз. В качестве префильтра использовали также мембранные фильтры с большим диаметром пор. В частности, для сывороток применяли сочетание мембран с размером пор 0,45 и 0,20 мкм после предварительной фильтрации через глубинные фильтры, при получении стерильного раствора трипсина — префильтры КФБЖ или КФМП в одном комплекте между мембранами (0,80; 0,45 и 0,20 мкм).

В производственных условиях (Ставропольская биофабрика) освоили метод ультрафильтрации при очистке и концентрировании раствора альбумина на мембранной тонкоканальной установке ФТО-01 (г. Ленинград). Конечный раствор содержал 0,2 % солей и 10 % белка, что соответствовало требованиям инструкции по приготовлению питательной среды ГНКИ для культивирования патогенных лептоспир. При необходимости установка ФТО-01 позволяет повышать концентрацию белка в растворе до 40-45 %.

Для ускорения процедуры диализа при обессоливании альбумина  использовали метод электродиализа, что позволило в циркуляционном режиме проводить обессоливание до нужной степени (0,2-0,1 %), сократив затраты времени в 10 раз по сравнению обычным диализом. В условиях производства получили восемь серий обессоленного альбумина.

Очистку, концентрирование растворов белков, ферментов, вирусных и бактериальных суспензий, питательных сред проводили c помощью ультрафильтрационных аппаратов на полых волокнах (НИИ «Химволокно», г. Мытищи, Московская обл.). Вирусную суспензию концентрировали по объему в 40 раз и более, раствор трипсина — в 6-7 раз.

С о в е р ш е н с т в о в а н и е  т е х н о л о г и и  п р о и з в о д-
с т в а  т р и п с и н а. В результате оптимизации технологических процессов на всех этапах была разработана современная технология производства трипсина сухого для вирусологических целей, обеспечивающая улучшение качества получаемого препарата, а также предложена технологическая линия производства фермента и составлена нормативно-технологическая документация — технологические условия (ТУ), технологический регламент, (ТР) и наставления по применению.

Совершенствование технологии проводили за счет применения высокопроизводительных методов разделения суспензии, полученной экстрагированием фермента из поджелудочной железы КРС, со ступенчатым высаливанием балластных веществ и трипсина, последующим центрифугированием, а также сепарированием вместо фильтрации через марлю и ткань Бета.повысить активность препарата на 20-30 %.

Сушку трипсина осуществляли распылением или сублимацией. Эти методы превосходили по эффективности калориферный и кондуктивный способы, исключили процессы измельчения и просеивания сухого трипсина, в результате чего улучшилось физико-химические характеристики препарата, а его активность возросла в 2 раза. Весь технологический процесс изготовления фермента сократился в 1,5-2,0 раза. Полученный препарат сохранял исходные физико-химические и протеолитические свойства в течение 2 лет хранения при температуре 2-6 °С (табл.).

Технология изготовления трипсина сухого была внедрена на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах, во ВНИТИБП (г. Щелково, Московская обл.) и в НПО «Синтез» (г. Курган). Опытно-промышленные серии трипсина успешно использовали на предприятиях биологической промышленности, производящих серии вакцины против болезни Марека, чумы плотоядных, болезни Ауески и трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Таким образом, предложенные способы суспензионного и псевдосуспензионного культивирования послужили основой для создания регламента культивирования клеток и вирусов. Проведенные сравнительные исследования различных способов очистки, разделения, концентрирования, обессоливания и стерилизации биологических растворов позволили использовать в числе приемов, применяемых при получении биопрепаратов и ферментов, методы ультрафильтрации, макро- и микрофильтрации, электродиализ. Безасбестовые фильтры-пластины рекомендованы для предварительной, тонкой очистки и стерилизации биологических растворов и жидкостей, а безасбестовый картон — в качестве префильтра, увеличивающего пропускную способность мембранных фильтров. Усовершенствованная технология выделения трипсина позволила сократить продолжительность процесса его производства в 2 раза. В свою очередь, полученный препарат трипсина был успешно использован в производственных условиях для получения культур клеток и вирусных препаратов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К р ю к о в  С.В.,  Р а х м а н и н  П.П.,  М е л ь н и к  Н.В.,  С о л о в ь е в  Б.В. Состояние агропромышленной промышленности в России. Мат. Межд. науч.-практ. конф., посвященой 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2006: 19-22.
2. Т и х о н о в  И.В.,  Р у б а н  Е.А.,  Г р я з н е в а  Т.Н.,  С а м у й л ен к о  А.Я.,  Г а в-
р и л о в  В.А. Биотехнология /Под ред. Е.С. Воронина. СПб, 2005.
3. Л у к и н а  В.А. Вакцина против болезни Марека и оценка ее активности иммуноферментным анализом. Автореф. докт. дис. М., 1992.
4. С о л о в ь е в  Б.В. Технология производства культуральных вакцин против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни. Автореф. докт. дис. М., 2001.

DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF BIOTECHNOLOGY OF MANUFACTURING OF VETERINARY PREPARATION AND ENZYMES

V.M. Popova, I.I. Kochish, I.L. Bero, A.Ya. Samuilenko, A.I. Guslavskii

The authors compared the different techniques for the cultivation of cells and viruses on preparatory stages of manufacturing of biopreparations, and also the methods of purification, division, concentration, desalination and sterilization of biological solutions. The technology of trypsin production was optimized, in plant conditions the examination of its experimental series was made.

Key words: biotechnology, veterinary drugs, cultivation of cells, the enzyme trypsin, filter media, membranes, filters, filtration, microfiltration, electrodialysis.

Оформление электронного оттиска