УДК 633.13:579.869.1:579.23

ВЫЖИВАЕМОСТЬ И МОРФОЛОГИЯ ЛИСТЕРИЙ В ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ КОРМОВОГО ОВСА

А.А. ВЛАСОВ, И.Б. ПАВЛОВА

Методом сканирующей электронной микроскопии изучали морфологию популяций листерий внутри листовых пластинок овса при экспериментальном заражении стерильных проростков. Показан гетероморфизм клеток в тканях вегетативных органов растений. Высевы гомогената из листьев овса, контаминированных листериями, показали высокую выживаемость бактерий, что свидетельствует о культивируемом состоянии популяции листерий в растениях и реверсии гетероморфных клеток в исходное состояние.

Ключевые слова: листерии, кормовая культура овса, выживаемость, популяция, гетероморфизм, морфология, сканирующая электронная микроскопия.

 

Необходимость экологических исследований, позволяющих понять сложные пути циркуляции психрофильных условно-патогенных и патогенных листерий в окружающей среде, связана с биологическими особенностями этих бактерий, которые в настоящее время признаны возбудителями сапрозоонозов, обладающими убиквитарностью и высокой приспособляемостью в широком диапазоне температур — от +4 до -45 °C. Адаптационный механизм позволяет листериям сохранять жизнеспособность и размножаться в различных условиях (в почве, воде, кормах, растениях, продуктах питания и др.). Большое внимание исследователи уделяют возможности распространения листериоза при хранении зеленой массы (1). Инфицированные корма служат источником заражения животных листериозом, при этом установлена корреляция между вспышками заболевания и использованием силоса в качестве корма (1). В Ирландии листериоз называют «силосной болезнью» (2).

Такие психрофильные бактерии, как иерсинии и листерии, обнаружены в овощах, корнеплодах, в злаковых культурах, водорослях и других объектах (2). В то же время сведения о взаимоотношениях между растениями и листериями весьма ограничены и фрагментарны.

Нашей задачей было изучение возможности проникновения листерий Listeria innocua в растения кормового овса, а также выживаемости и морфологии популяции L. innocua в растительных тканях.

Методика. Для выполнения экспериментов разработали методику, позволяющую регистрировать проникновение листерий через корневую систему в вегетативные органы растения с применением сканирующей электронной микроскопии в сочетании с оценкой выживаемости бактерий. За основу был взят способ изучения листерий в растениях, описанный в монографии В.Ю. Литвина с соавт. (2).

В опытах использовали семена кормового овса сорта Улов, распространенного в различных климатических зонах России. Поскольку предварительно была определена их общая микробная обсемененность, которая составила 107 КОЕ/мл (исследование выявило энтеробактерии, кокки и сапрофитные грибы), для деконтаминации проводили обработку антибиотиками (линкомицин — 100 мкг/мл, рифампицин — 100 мкг/мл, гентамицин — 20 мкг/мл) в течение 2 ч, затем фунгицидным препаратом (нистатин в дозе 10 мкг/мл) также в течение 2 ч. Семена трижды промывали стерильным двузамещенным фосфатным буфером (pH 7,0). После обработки всхожесть составляла 60-70 %. Далее семена проращивали при комнатной температуре в течение 4-6 сут в стерильных чашках Петри на подложке из ваты, смоченной стерильной водопроводной водой. Каждый проросток помещали в стерильный стакан высотой 15 см и объемом 200 мл таким образом, чтобы в почве находились только корни проростков. Растения закрывали стерильным стеклянным колпаком и выращивали при температуре 18-20 °С в течении 2 нед. 

В опытах использовали 48-часовую культуру L. innocua (штамм 6-06 из коллекции Всероссийского НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии — ВНИИВСГЭ, г. Москва) в S-форме, типичную по культурально-биохимическим свойствам. Взвесь клеток (2½109/мл, 1 мл) вносили в стерильную почву (рН 7,0-7,2) стерильным шприцем строго в околокорневую зону растений, не касаясь корневых волосков.

Для количественного учета листерий по КОЕ выполняли периодические высевы гомогенатов вегетативных органов (корня и стебля раздельно) на мясопептонный агар (МПА) с 1 % глюкозы и дифференциально-диагностическую среду для листерий («Merck», Германия). Посевы инкубировали при 37 °С  в течение 2 сут. Пробы отбирали через 3, 7 и 14 сут. Идентификацию листерий проводили после каждого высева — на 3-и, 7-е и 14-е сут с помощью микроскопии окрашенных по Граму препаратов. Кроме того, выполняли тест на активность каталазы (ГОСТ 30425).

При морфологическом изучении популяции листерий в растениях методом сканирующей электронной микроскопии готовили препараты из корневых волосков и листьев овса. Для этого исследуемые фрагменты фиксировали в 4 % растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,0) и обезвоживали в этиловом спирте (возрастающие концентрации). После выдерживания в 70° спирте объекты препарировали, снимая эпидерму (оболочку) листовой пластинки лезвием бритвы, переносили в 96° и 100° спирт, после чего помещали на медные подложки и напыляли ионами золота на установке Hitachi Е-102 (Япония). Электронно-микроскопи-ческие исследования проводили на микроскопе Hitachi-800 со сканирующей приставкой Hitachi-8010 (Япония).

Результаты. В контрольных образцах вегетативных органов овса методом сканирующей электронной микроскопии были обнаружены контурированные края оболочки и внутренняя часть листа, представленная гранулированной тканью — хлоренхимой (паренхимой). Микробная контаминация не наблюдалась (рис. 1, а, б). Изучение поверхности корневых волосков овса выявило их ветвистое трубчатое строение (см. рис. 1, в).

Рис. 1. Контрольные проростки овса сорта Улов, полученные из обеззараженных семян: а — общий вид; б, в — соответственно фрагмент листовой пластинки (эпидерма снята, видна хлоренхима; сканирующая электронная микроскопия — СЭМ, увеличение ×5000) и корневые волоски через 3 сут (СЭМ, увеличение ×4000).

Бактериологические и морфологические исследования показали, что листерии проникали через проводящую систему корней в листовые пластинки. При этом после гомогенизации инфицированных корней и листовых пластинок с последующим высевом на дифференциально-диагности-ческую среду титр листерий в гомогенате тканей корней составлял 108 КОЕ/мл, стебля — 107 КОЕ/мл. Рост колоний листерий на дифференциально-диагностической среде был типичным (S-форма) (рис. 2, а, б). Микроскопия окрашенных по Граму препаратов также выявила морфологически типичные листерии. Каталазная активность листерий, выделенных из листовых пластинок и корней через 3 сут после заражения, полностью сохранялась.

Рис. 2. Рост листерий на дифференциально-диагности-стической среде («Merck», Германия): а, б — соответственно гомогенат тканей корня (сплошной посев) и листовых пластинок (отдельные колонии).

При исследовании препарата, полученного из листовых пластинок контаминированного растения (3-и сут эксперимента) было обнаружено большое число гетероморфных (округлых или продолговатых) клеток листерий неправильной формы протопластного типа с дефектной клеточной стенкой, локализованных в основном в хлоренхиме листовой пластинки (рис. 3, а). Через 7 сут такие скопления в листовых пластинках, корне и корневых волосках овса сохранялись. Колонии визуально были гладкими (S-форма), при окраске по Граму листерии имели типичную морфологию, проявлялась каталазная активность. Через 7 сут в листовой пластинке овса также обнаруживались популяции гетероморфных клеток листерий в хлоренхиме (см. рис. 3, б). Через 14 сут листовые пластинки овса пожелтели, титры листерий в их гомогенатах снизились до 106 КОЕ/мл, в то время как в гомогенатах корневой части не изменились и составили 108 КОЕ/мл, что свидетельствовало о культивируемом состоянии бактерий в тканях этих органов. При сканирующей электронной микроскопии препаратов из листовых пластинок на поверхности хлоренхимы наблюдали популяцию гетероморфных клеток листерий — от шаровидных до палочковидных форм, по морфологическим критериям сходных с клетками протопластного типа (см. рис. 3, в).

Рис. 3. Фрагменты листовой пластинки проростка овса сорта Улов, контаминированного листериями, через 3 (а), 7 (б) и 14 сут (в). Эпидерма листовой пластинки снята, на поверхности хлоренхимы видны гетероморфные клетки листерий (а, б) и их популяция (в). Сканирующая электронная микроскопия, увеличение соответственно ×4000, ×21 000 и ×8000.

Полученные нами с использованием метода сканирующей электронной микроскопии экспериментальные данные согласуются с выводами других исследователей о том, что листерии проникают из почвы в капиллярную систему корневых волосков и корней, далее с соками — внутрь листовых тканей (2).

Известно, что взаимодействие растений с условно-патогенными и патогенными бактериями сложны и обусловлены способностью бактерий вызывать патологию, а растений — угнетать жизнедеятельность фитопатогенов (3). На всех сроках эксперимента в тканях листовых пластинок овса был выявлен гетероморфизм клеток листерий, обусловленный дефектностью их клеточной стенки. Такое угнетение развития и роста этих бактерий, по-видимому, связано с защитной реакцией растения, а именно с воздействием биологически и физиологически активных веществ, вырабатываемых в ответ на внедрение патогенов. Так, описано увеличение содержания салициловой кислоты в листьях проростков озимой пшеницы под воздействием фитопатогенов (4). Сообщалось об антистафилококковой активности глюкозидов — биологически активных веществ, выделенных из листьев березы (5). Имеются данные об участии в иммунных реакциях растений физиологически активных веществ — витаминов, гормонов и др. (6). Мы использовали обработанные антибиотиками и фунгицидами семена овса, но в природных условиях при проникновении в растения фитопатогенов им может противодействовать индигенная микрофлора (7). Можно предположить, что выявленный гетероморфизм листерий, находящихся в тканях растений овса, связан с защитными реакциями злаковой культуры. Однако следует отметить, что популяция листерий при этом персистентна и высевается даже из пожелтевших частей растений, причем выявленный обильный рост листерий свидетельствует о реверсии гетероморфных клеток в S-форму.

Таким образом, показано культивируемое состояние популяций листерий в растительных тканях. Следовательно, кормовые травы и злаковые культуры при силосовании могут выступать в качестве резервуара листериозной инфекции, что имеет большое эпизоотологическое значение, поскольку для реверсии бактериальных клеток достаточно питательного субстрата, оптимальной температуры, влажности и кислотности среды.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Г е р ш у н  В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата, 1981.
2. Л и т в и н  В.Ю.,  Г и н ц б у р г  А.Л.,  П у ш к а р е в а  А.Л. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., 1998: 115-118.
3. Т и м ч е н к о  Н.Ф.,  Н е д а ш к о в с к а я  Е.П.,  Д о л м а т о в а  Л.С. и др. Токсины Yersiniapseudotuberculosis. Владивосток, 2004: 170-187.
4. К р ю ч к о в а  Л.А.,  М а к о в е й ч у к  Т.И.,  Я в о р с к а я  В.К. и др. Содержание салициловой кислоты в листьях проростков озимой пшеницы различной устойчивости к фитопатогенам. Физиол. и биохим. культ. раст., 2006, 38(1): 24-31.
5. С т е х о в а  С.И.,  А н и с и м о в  М.М.,  А т о п к и н а  Л.Н. и др. Связь между химическим строением и антимикробной активностью полиолов даммаранового ряда и их глюкозидов. Физиол. и биохим. культ. раст., 2006, 38(1): 99-100.
6. А н д р е е в  Л.Н.,  Т а л и е в а  М.Н. Физиология взаимоотношений растения-хозяина и патогена: роль физиологически активных веществ. М., 1995.
7. С м и р н о в а  И.Э. Целлюлолитические бактерии в защите сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов. Микол. и фитопатол., 2004, 38(2): 89-93.

 

VIABILITY AND MORPHOLOGY OF LISTERIA IN TISSUES OF FORAGE OATS

A.A. Vlasov, I.B. Pavlova

By the method of scanning electron microscopy the authors investigated the morphology of listeria population in oats laminas during experimental infection of sterile seedlings. The heteromor-phism of cells in tissues in vegetative plants organs was shown. The cultivation of homogenate from oats leaves infected by listeria have shown the high viability of bacteria, that suggested about the reproduction of listeria population in plants and the reversion of heteromorphous cells to initial state.

Key words: lister, green crop of oats, survival, population, heteromorphism, morphology, scanning electron microscopy.

 

ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной санитарии,
гигиены и экологии Россельхозакадемии,

123022 г. Москва, Звенигородское ш., 5,
e-mail: murkalp@mail.ru

Поступила в редакцию
5 мая 2009 года

 

 

 

 

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало