Сельскохозяйственная биология, 2008, № 4, с. 75-79.

УДК 636.32/.38:591.11.1:57.04

СОДЕРЖАНИЕ КАЛЬЦИЯ В ЛИМФОЦИТАХ И ТРОМБОЦИТАХ ОБЛУЧЕННЫХ ОВЕЦ

Т.С. ШЕВЧЕНКО, И.В. КОНОПЛЕВА

У овец породы прекос определяли общее содержание Ca²⁺ в лимфоцитах и тромбоцитах, выделенных из периферической крови, после внешнего γ-облучения в дозах 2, 4 и 6 Гр. Показано, что развитие радиационного поражения организма сопровождается значительным изменением содержания внутриклеточного Ca²⁺ в лимфоцитах с 1-х сут после воздействия. Выявлено увеличение содержания Ca²⁺ в лимфоцитах в 1,5-4,5 раза на 1-30-е сут после облучения животных. В тромбоцитах облученных овец общее содержание Ca²⁺ сохраняется на уровне контроля в течение 30 сут.

Ключевые слова: овцы, внешнее γ-облучение, лимфоциты, тромбоциты, общее содержание кальция.

Внешнее γ-облучение млекопитающих в дозах от сублетальной до летальной приводит к развитию острой лучевой патологии, которая характеризуется глубокими изменениями в системе кроветворения (1). Отмечается гибель радиочувствительных клеток костного мозга и периферической крови, особенно лимфоцитов и тромбоцитов (2).

В механизмах повреждения и гибели клеток особая роль принадлежит Са²⁺ как вторичному мессенджеру (3). При физиологических концентрациях Са²⁺ выступает в качестве одного из универсальных внутриклеточных регуляторов метаболических процессов, однако его избыток вызывает цитотоксический эффект (4).

Поскольку опустошение лейкоцитарной и тромбоцитарной популяций в периферической крови имеет важное значение в патогенезе лучевой болезни, целью работы была оценка общего содержания Са²⁺ в тромбоцитах и лимфоцитах овец, подвергнутых внешнему γ-облучению в разных дозах.

Методика. Исследования проводили на 32 овцах породы прекос с живой массой 30,5-34,2 кг, содержащихся в условиях вивария Всероссийского НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии. Рацион животных был сбалансирован по основным питательным веществам согласно нормам Всероссийского НИИ животноводства.

Овец подвергали тотальному внешнему γ-облучению в дозах 2, 4 и 6 Гр при мощности дозы 1 Гр/ч на установке ГУЖ-24 (Россия) (источник излучения — ¹³⁷Cs с энергией γ-квантов 0,67 МэВ). Контроль за интенсивностью и равномерностью облучения осуществляли с помощью сферической ионизационной камеры АК-253 (Россия) (неравномерность γ-поля не превышала ±15 %).

Кровь отбирали из яремной вены до облучения и на 1-, 3-, 7-, 15- и 30-е сут после облучения. Антикоагулянтом служил цитрат натрия в конечной концентрации 0,38 %. Популяции тромбоцитов и лимфоцитов выделяли разработанным нами способом (5).

Среда промывки содержала: NaCl, KCl, K₂HPO₄, MgCl₂, глюкозу и N-2-(гидроксиэтил)пиперазин-N-2-этансульфоновую кислоту — соответственно 145,0; 5,0; 0,5; 1,0; 3,0 и 10,0 мМ (рН 7,4). Клетки в полученных суспензиях подсчитывали в камере Горяева (их жизнеспособность, оцениваемая в тесте с трипановым синим, составляла 90-95 %). Общее содержание белка в клеточных популяциях определяли по Лоури (6), содержание Са²⁺ в клетках и плазме — методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (модель 703, «Perkin-Elmer», США). К осадкам выделенных клеток приливали 50-100 мкл концентрированной НNО3, анализ проводили в присутствии 0,5 % LaCl₃ (7). Учитывали также общее состояние, поведение, реакцию на внешние раздражители, аппетит, температуру тела, частоту пульса и дыхания, функциональное состояние желудочно-кишечного тракта, динамику живой массы, продолжительность жизни и гематологические показатели животных общепринятыми способами.

Результаты исследований обрабатывали статистически (различия признавали достоверными при р < 0,05).

Результаты. Внешнее тотальное γ-облучение овец приводило к развитию острой лучевой болезни различной степени тяжести. Клинико-гематологическое обследование животных выявило при дозах облучения 2, 4 и 6 Гр соответственно легкую, среднюю и тяжелую степень лучевого поражения. В течение 30 сут гибель овец составила 100 % при дозе 6 Гр (летальная) и 50 % — при 4 Гр (полулетальная). При дозе 2 Гр (сублетальная) выжили все животные. Как известно, наиболее информативные гематологические показатели для оценки радиационного воздействия — содержание лимфоцитов и нейтрофилов (лейкоцитов) в периферической крови животных. С 1-х сут после облучения сублетальной дозой наблюдали снижение числа лейкоцитов на 12-15, полулетальной — на 25-30 и летальной — на 50-60 %. В период разгара острого лучевого поражения (15-е сут) отмечали более резкое уменьшение содержания лейкоцитов: при дозе 2, 4 и 6 Гр — соответственно на 25-30, 45-50 и 90-95 %.

Определение общего содержания внутриклеточного Са²⁺ в тромбоцитах и лимфоцитах необлученных овец показало, что его значения составляли в среднем соответственно 2,42±0,25 и 2,33±0,31 мкг/мг белка. После внешнего γ-облучения овец общее содержание Са²⁺ в тромбоцитах практически не отличалось от исходного независимо от срока исследования и дозы воздействия (табл.). То есть при развитии лучевой патологии разной степени тяжести как в начальный, так и в наиболее острый период болезни содержание внутриклеточного Са²⁺ в тромбоцитах оставалось неизменным и в этой клеточной популяции сохранялся стабильный баланс Са²⁺.

Существенно иной характер динамики клеточного пула Са²⁺ был  выявлен в лимфоцитах. С 1-х сут после облучения животных отмечали повышение общего содержания внутриклеточного Са²⁺. При облучении в сублетальной дозе величина показателя на 1-е и 3-и сут возрастала в 1,5-1,9 раза, на 7-, 15- и 30-е сут — соответственно в 2,2; 2,7 и 1,9 раза, в полулетальной дозе на 1-е и 3-и сут — в 2,6-3,7, на 7-, 15- и 30-е сут — соответственно в 3,2; 2,5 и 1,4 раза. При воздействии летальной дозы содержание Са²⁺ в лимфоцитах возрастало на 1-, 7- и 30-е сут — соответственно в 4,5; 1,8 и 2,3 раза по сравнению с контролем (см. табл.). То есть в лимфоцитах облученных овец с 1-х по 30-е сут нарушался кальциевый баланс со значительными (в 1,5-4,5 раза) изменениями содержания Са²⁺ в цитозоле клеток.

Таким образом, после внешнего γ-облучения животных наблюдалась следующая закономерность: в тромбоцитах общее содержание Са²⁺ оставалось постоянным, в лимфоцитах — многократно возрастало в течение всего срока исследования. При увеличении дозы облучения регистрировали более высокие значения показателя, особенно на 1-е сут после воздействия.

Изменение содержания внутриклеточного кальция в лимфоцитах при облучении животных, возможно, определяется нарушением гомеостаза Са²⁺в плазме крови. Известно, что оценка общего содержания Са²⁺ в плазме крови — одна из основных характеристик гомеостаза Са²⁺ в организме, который, как правило, у здоровых млекопитающих поддерживается на определенном стационарном уровне системой кальций-фосфорного обмена (8). У необлученных овец величина этого показателя составляла в среднем 2,19±0,16 мМ. После внешнего γ-облучения животных в дозах от сублетальной до летальной содержание Са²⁺ в плазме крови сохранялось на уровне контрольных значений в течение 30 сут (см. табл.).

Следовательно, общее содержание Са²⁺ в плазме крови, оставаясь стабильным и не зависящим от дозы радиационного воздействия, не оказывает влияния на содержание Са²⁺ в клеточных популяциях. Таким образом, в облученном организме действительно происходило нарушение кальциевого баланса в лимфоцитах, относящихся к наиболее радиационно чувствительным клеткам. Поскольку резкое увеличение внутриклеточного пула Са²⁺ с 1-х сут лучевой патологии совпадает с периодом интерфазной гибели лимфоцитов, можно предположить наличие связи между нарушением функционирования системы кальциевого обмена в лимфоцитах и массовой гибелью этих клеток.

В клетках основная часть ионов кальция связана с белками, матриксом, внутриклеточными органеллами, гранулами и Са²⁺-хелатирующими соединениями (9).  В тромбоцитах кальций локализуется в Са²⁺-секвест-рирующих гранулах, а в лимфоцитах имеются два основных пула компартментализации — эндоплазматический ретикулум/кальцисомы и митохондрии. В отличие от эндоплазматического ретикулума в митохондриях интактных лимфоидных клеток емкость кальциевого пула находится в ненасыщенном состоянии, и при различных повреждающих воздействиях митохондрии способны аккумулировать дополнительные количества ионов Са²⁺ (до 0,5 мМ) (10). Отметим, что для тромбоцитов характерно минимальное число митохондрий.

Представленные экспериментальные данные позволяют объяснить различия в реакциях клеточных популяций крови на изменение общего содержание кальция при облучении животных. Во-первых, устойчивость тромбоцитов к цитотоксическому действию кальция связана с тем, что после облучения в этих клетках поддерживается кальциевый баланс (вероятно, с помощью Са²⁺-насоса, Nа⁺—Са²⁺ обмена и Са²⁺-гранул) (11), а повышенная чувствительность лимфоцитов — наоборот, обусловлена нарушением Са²⁺-баланса и накоплением Са²⁺ в цитозоле, а затем и митохондриях, что приводит к ингибированию окислительного фосфорилирования и синтеза макроэргических соединений, вследствие чего снижается энергообеспеченность клетки. Во-вторых, ионы Са²⁺ в лимфоцитах взаимодействуют со специфическими Са-связывающими белками (кальмодулин, кальсеквестрин и др.), влияющими на метаболическое и функциональное состояние клетки. Повышение содержания внутриклеточного Са²⁺ в лимфоцитах является одним из наиболее существенных факторов в стимуляции цитотоксического процесса, эффект которого реализуется через Са²⁺-зависимую активацию нуклеаз и протеаз, повреждающих молекулы ДНК и хроматин, что приводит к фрагментации ДНК и гибели лимфоидных клеток (12, 13). 

Итак, развитие радиационного поражения организма при внешнем γ-облучении в дозах от сублетальной до летальной сопровождается нарушением кальциевого гомеостаза и накоплением Са²⁺ в лимфоидной популяции клеток как в латентный, так и в острый период лучевой болезни на фоне стабильного содержания Са²⁺ в тромбоцитах. Очевидно, что отмеченные в лимфоцитах пострадиационные изменения пула Са²⁺ приводят к нарушениям метаболических процессов в цитозоле и повреждению клеточных органелл вплоть до гибели клетки.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Б о н д  В.,  Ф л и д н е р  Т.,  А р ш а м б о  Д. Радиационная гибель млекопитающих. Нарушение кинетики клеточных популяций. М., 1974.
2. Б е л о у с о в а  О.И.,  Г о р и з о н т о в  П.Д.,  Ф е д о т о в а  М.Н. Радиация и система крови. М., 1979.
3. R a s m u s s e n  H.,  B a r r e t t  P.Q. Calcium messenger system an integrated view. Physiol. Rev., 1984, 64: 938-984.
4. F a r b e r  J.I. The role of calcium in cell death. Life Sci., 1981, 29(13): 289-295.
5. Ш е в ч е н к о  Т.С. Выделение клеточных популяций из периферической крови сельскохозяйственных животных. С.-х. биол., 2007, 6: 123-126.
6. L o w r y  O.H.,  R o s e b r o u g h  N.G.,  F a r r  A.L. e.a. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193: 265-275.
7. П р а й с  В. Аналитическая атомно-абсорбционная спектрофотометрия. М., 1976: 273-276.
8. М о с к а л е в  Ю.И.,  С т р е л ь ц о в а  В.Н. Отдаленные последствия радиационного поражения. Неопухолевые формы. В сб.: Итоги науки и техники. Сер. «Радиационная биология» (ВИНИТИ). М., 1987, т. 6.
9. О р л о в  С.Н. Кальмодулин. В сб.: Итоги науки и техники. Сер. «Общие проблемы физико-химической биологии» (ВИНИТИ). М., 1987. т. 8.
10. B e r r i d g  M.J. Inositol triphosphate and diacylglycerol: two interacting second messenger. Ann. Rev. Biochem., 1987, 54: 159-194.
11. M i k k e l s e n  R.B.,  S t e d m a n  T. Cytotoxic hiperthermic and Са2+ homeostasis: the effect of heat on Са2+ uptake by non mitochondrial intracellular Са²⁺ stores. Radiat. Res., 1990, 123(1): 82-86.
12. S t o r y  M.D.,  S t e p h e n e s  L.C.,  T o m a s o v i c  S.P. e.a. A role for calcium regulating apoptosis in rat thymocytes irradiated in vitro. Int. J. Radiat. Biol., 1992, 61: 243-251.
13. Ш е в ч е н к о  А.С.,  Г а б а й  В.Л.,  Ш е в ч е н к о  Т.С. и др. Нарушение проницаемости плазматической мембраны для ионов Са²⁺при радиационно-индуцированном апоптозе тимоцитов. Докл. РАН, 1997, 353: 284-286.

TOTAL CONTENT OF CALCIUM IN LYMPHOCYTES AND THROMBOCYTES OF IRRADIATED SHEEPS

T.S. Shevchenko, I.V. Konopleva

The total Ca²⁺ content has been studied in the lymphocytes and thrombocytes isolated from the peripheral blood of sheeps exposed to external γ-radiation at doses of 1.2, 2.3 and 3.5 Gy. The development of radiation damage to the body is accompanied by significant changes in the content of intracellular Ca²⁺ in the lymphocytes from the first day after exposure. The 1.5-4.5-fold increase of Ca²⁺ content was shown in the lymphocytes from 1st to 30th day after irradia-tion. In the thrombocytes of irradiated sheeps the total Ca²⁺ content remains at the level of control values for 30 days.

Key words: sheeps, external γ-radiation, the lymphocytes, the thrombocytes, the total Ca²⁺ content.

Оформление электронного оттиска