БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ

ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ

КАРТА САЙТА

НА ГЛАВНУЮ

Сельскохозяйственная биология, 2008, № 4, с. 101-105.

УДК 636.028:57.083

АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ СВИНЕЙ ПРИ ВКЛЮЧЕНИИ В ЕЕ СОСТАВ АДЪЮВАНТОВ

Е.В. ШЕМЕЛЬКОВ, Ю.Н. ФЕДОРОВ, О.А. ВЕРХОВСКИЙ

В опытах на лабораторных животных проводили сравнительную оценку влияния разных типов адъювантов на антигенную активность вакцинных препаратов против инфекционных болезней свиней. Показано, что наибольшей эффективностью обладают иммунозоли, обеспечивающие выработку большего количества специфических антител к вирусным и бактериальным компонентам вакцины, чем масляный адъювант и гидроокись алюминия.

Ключевые слова: адъювант, иммунный ответ, антитела, иммунозоль, лабораторные животные, антигенная активность.

 

В свиноводстве для профилактики инфекционных болезней часто используют инактивированные вакцины в сочетании с иммунологическими адъювантами — веществами, действующими неспецифически и повышающими специфический иммунный ответ (1, 2). Согласно ранее существовавшим представлениям, роль адъювантов сводится к удержанию антигена на месте введения, благодаря чему последующее его освобождение приводит к вторичному иммунному ответу после первичной стимуляции. Понимание неоднозначности действия адъювантов пришло сравнительно недавно в процессе изучения надмолекулярной организации и презентации антигенов. Установлено, что иммуноген содержит антигенную (эпитоп) и адъювантную части. Интенсивность иммунного ответа зависит от собственной адъювантности молекулы иммуногена. Адъювант может модифицировать электрический заряд или конформацию эпитопа, повышая его антигенность. Есть основания полагать, что адъювантность соответствующей части антигена пропорциональна ее молекулярной массе (3).

Адъюванты взаимодействуют с наиболее важными антигенпрезентирующими (АПК-макрофаги, клетки Лангерганса, дендритные клетки) и эффекторными (плазматические и NK-клетки) клетками, ТH-клетками и клетками воспаления (полиморфно-ядерные базофилы, эозинофилы). В зависимости от адъюванта и способа его введения каждый тип клеток может вести себя по-разному: пролиферировать, дифференцироваться, менять клеточные рецепторы и т.д. Различные адъюванты влияют на индукцию и регуляцию синтеза разных классов антител, образование В-клеток памяти и развитие клеточного иммунитета (4). В организме комплексное взаимодействие иммунокомпетентных клеток с адъювантами находится под частичным или полным генетическим контролем, но сложность и гетерогенность строения антигенов и адъювантов затрудняет выяснение механизма иммунного ответа (5).  

В настоящее время существует несколько типов адъювантов. Адъювантное действие гидроокиси алюминия (ГОА) открыто в 20-х годах прошлого столетия А.Т. Глени с соавт. (5). При смешивание с гелем Al(OH)3 антиген адсорбируется на нем посредством ионного взаимодействия, в связи с чем такие вакцины получили название адсорбированных, или сорбированных (5). Адъювантность солей алюминия, по-видимому, обусловлена совместным проявлением нескольких механизмов: предотвращением быстрого распространения антигена от места инъекции, его дренированием через лимфатические узлы, улучшением связи антигена с макрофагами и их активацией, стимуляцией и задержкой Т-лимфоцитов в лимфатических узлах (6).

В последнее время в практику вошли адъюванты, приготовленные на основе минеральных и неминеральных масел. При их использовании предварительно растворенный или суспендированный в водной фазе антиген тонко диспергируют в масле, в результате чего получают эмульсию типа «вода в масле» (5). Для предотвращения расслоения таких эмульсий используют липофильный (маннид моноалеата — Монтанид или Маркол-52 с добавкой Спана-85) или гидрофильный (Твин-80) эмульгатор, способствующий повышению дисперсности водных капель вакцины в масляной фазе (7). Механизм влияния масляных адъювантов на иммунокомпетентные системы организма до конца не выяснен. Вероятно, он подобен механизму действия минеральных сорбентов. Несмотря на то, что эмульсии типа «вода в масле» высвобождают антиген в течение более длительного времени, чем сорбированные вакцины (8) и по своим адъювантным свойствам превосходят ГОА, они имеют ряд существенных недостатков, в частности, высокую вязкость и нестабильность в процессе хранения. Кроме того, после введения антиген-адъювантной эмульсии на месте инъекции образуется гранулема, стимулирующая активность макрофагов и лимфоцитов, которая сохраняется длительное время, в связи с чем при убое животных возникает необходимость зачистки туш (9).

Полный адъювант Фрейнда представляет собой водно-масляную эмульсию с добавлением убитых клеток микобактерий. По стимуляции иммунного ответа он не имеет себе равных. Однако из-за возможности таких нежелательных последствий, как формирование абсцессов, возникновение острой боли, лихорадки, аутоиммунных расстройств (аллергический энцефалит, аллергический артрит), адъювант Фрейнда не применяют в промышленном производстве вакцин. Его используют только в экспериментальных целях, в частности при получении гипериммунных сывороток (3, 10).

В настоящее время создан синтетический аналог обладающего адъювантным действием трипептидного моносахарида из клеточной стенки микобактерий — мурамил-дипептид (МДП). Он относительно нетоксичен, эффективен не только в масляных эмульсиях, но и в водных растворах, его можно вводить парентерально и орально. Известно множество производных МДП, большинство из которых стимулирует гуморальный иммунный ответ. Некоторые продукты распада МДП усиливают также клеточный иммунитет (3).

В 1974 году Г. Грегориадис предложил помещать лекарственные препараты внутрь липосом — замкнутых пузырьков водного раствора, окруженных одним или несколькими слоями липидов (11). Липосомы оказывают адъювантное действие прежде всего за счет «корпускулирования» — создания дискретных частиц, содержащих антиген. Их размеры обеспечивают стойкость эмульсии и иммуногенность препарата: малые липосомы (0,5-10 мкм) доступны для фагоцитоза, большие (50 мкм и более) служат лишь резервуаром для антигена. Липосомы снижают токсичность встроенных веществ, обладают хорошей биосовместимостью и биодеградируемостью, могут содержать несколько антигенов и дополнительные адъюванты. Для придания устойчивости эмульсиям, в состав которых входят липосомы, используют эмульгаторы (Твин-80, Арлацел, Фальба и др.). Липосомы широко применяют в экспериментальных исследованиях, предпринимаются попытки их использования для изготовления вакцин (3).

Из коры южноамериканского мыльного дерева Guillaja saponaria Molina экстрагируют адъювант сапонин. Очищенный препарат сапонина (Квил-А) относится к гликозидам и, будучи поверхностно активным веществом, может солюбилизировать гидрофобные молекулы. Молекулы Квил-А способны к мицеллообразованию. Связывая мономерные формы поверхностных вирусных белков, они формируют структуры типа пчелиных сот, обладающие выраженным иммуностимулирующим действием (иммуностимулирующий комплекс — ИСКОМ) (5).

Адъюванты серии IMS (иммунозоли), выпускаемые французской фирмой «SEPPIC», представляют собой жидкие наночастицы в сочетании с иммуностимулирующими соединениями размером 10-50 нм (12). Эти адъюванты могут проявлять эффект депо и вызывать медленное освобождение антигена, увеличивать число иммунокомпетентных клеток в результате микродиффузии капелек в лимфатической системе или облегчать поглощение антигена АПК. При этом могут быть задействованы и другие механизмы, такие как захват лимфоцитов, индукция цитокинов, изменение конформации антигена или модификация клеточных мембран (13). Вакцины, изготовленные с использованием иммунозолей, выгодно отличаются от масляных эмульсий тем, что не вызывают на месте введения образования длительно сохраняющихся гранулем и обладают более выраженными иммуностимулирующими свойствами, меньшей вязкостью, большей стабильностью в процессе хранения (12).

Целью нашей работы была сравнительная оценка влияния разных типов адъювантов на антигенную активность компонентов вакцины ПЛАР (инактивированная вакцина против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней).

Методика. Лабораторные опыты проводили на белых мышах, морских свинках и кроликах живой массой соответственно 18-20 г, 350-400 г и 3,0-3,5 кг. На первом этапе исследований готовили опытные образцы вакцины ПЛАР на основе вирусных и бактериальных компонентов с различными типами адъювантов: иммунозолями MONTANIDE IMS 1313 и MONTANIDE IMS 2214 (адъюванты серии MONTANIDE IMS, «SEPPIC», Франция) (I и II варианты); масляным адъювантом ISA 773 (смесь минерального и неминерального масел, «SEPPIC», Франция) (III вариант); ГОА (IV вариант). Вирусы болезни Ауески (ВБА, штамм К), репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС, штамм Lelystad) и парвовирус свиней (ПС, штамм ИЛ-82) выращивали в перевиваемой культуре клеток (соответственно СПЭВ, МАRС и ППЭС). В вакцинах лептоспиры серогрупп Pomona, TarassoviиIcterohaemorragiae содержание микробных клеток равнялось 1,5 млрд/см³. Вирусы и бактерии в составе вакцин инактивировали формалином в концентрации 0,3 % (ВБА и ПС — в течение 3 сут, РРСС — 24 ч при температуре 37 °С). Инфекционная активность ВБА и РРСС составляла соответственно 8,0 и 6,0 lg ТЦД₅₀/см³, гемагглютинирующая активность ПС — 1:1024.

Компоненты в I, II и III вариантах вакцины перемешивали на магнитной мешалке при 1200 об/мин в течение 5 мин, в IV варианте — механической мешалкой IKA T 25 basic (Германия) при 16000 об/мин в течение 3 мин.

Для определения безвредности образцы приготовленного препарата вводили внутрибрюшинно белым мышам (n= 10 на каждый вариант вакцины) в дозе 0,5 см³. Наблюдение за мышами проводили в течение 10 сут. В последующих опытах каждый вариант вакцины вводили в дозе 1 см3 внутримышечно морским свинкам (n = 4 на каждый препарат) и внутривенно кроликам (n = 3 на каждый препарат) 2-кратно с интервалом 30 сут. В опытах на кроликах препараты перед введением смешивали с физиологическим раствором в соотношении 1:5.

Пробы крови отбирали до вакцинации, на 30-е и 60-е сут после инъекции. Антигенную активность компонентов вакцины ПЛАР оценивали по уровню специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных, который определяли в реакциях нейтрализации (РН), торможения гемагглютинации (РТГА) и микроагглютинации (РМА). Постановку и учет результатов РН, РТГА и РМА осуществляли по стандартным методикам с использованием соответствующих штаммов вирусов и бактерий (14). Динамику поствакцинального ответа на иммунизацию ВБА и ПС анализировали на морских свинках, лептоспирами и вирусом РРСС — на кроликах, что обусловлено различной чувствительностью этих видов животных к указанным возбудителям.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по стандартным методикам (15) с использованием программы Excel для Windows.

Результаты. Данные о содержании компонентов в разных вариантах вакцины ПЛАР представлены в таблице 1.

1. Содержание компонентов (%) в разных вариантах вакцины против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ПЛАР)
Компонент	Вариант вакцины
	I	II	III	IV
ВБА	12,50	12,50	7,50	18,75
Вирус РРСС	12,50	12,50	7,50	18,75
Парвовирус	5,0	5,0	3,0	7,5
Лептоспиры	20	20	12	30
Мертиолят Na (10 % раствор)	0,1	0,1	0,1	0,1
Физиологический раствор	—	—	—	5
Адъюванты:   IMS 1313	50	—	—	—
IMS 2214	—	50	—	—
ISA 773	—	—	70	—
ГОА	—	—	—	20
П р и м е ч а н и е. ВБА, РРСС — соответственно вирусы болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней; ГОА — гидроокись алюминия. Прочерк означает отсутствие компонента.

В опытах на мышах введение испытуемых вариантов ПЛАР не приводило к гибели животных и возникновению патологических изменений на месте инъекции. У морских свинок и кроликов введение всех вариантов ва-кцины вызывало выраженный как первичный, так и вторичный иммунный ответ (Р < 0,01). Различные типы адъювантов оказывали неодинаковый эффект на подопытных животных (табл. 2).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Так, у животных, которым вводили ПЛАР, содержащую в качестве адъюванта ГОА (IV вариант), после первого применения установлен более высокий титр антител к ВБА и ПС по сравнению с другими препаратами, однако повторная вакцинация не сопровождалась значительным приростом количества антител. В то же время первое введение вакцины с IMS 1313 (I вариант) стимулировало синтез антител к ВБА и ПС в титрах, незначительно отличающихся от IV варианта, а вторичный иммунный ответ характеризовался их максимальными значениями. Этот вариант вакцины значительно превосходил остальные по способности вызывать выраженный иммунный ответ в отношении лептоспир. Установлены статистически достоверные различия между титрами антител к лептоспирам у кроликов I группы и аналогичными показателями у животных в других группах (Р < 0,05). Титр специфических антител у лабораторных животных, иммунизированных II и III вариантами вакцины, после первого введения был ниже, чем у двух других групп, но повторная вакцинация обеспечивала более высокий уровень специфических антител по сравнению с I вариантом.

Таким образом, все испытанные адъюванты в составе вакцины ПЛАР (инактивированная вакцина против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней) оказывают выраженный иммуностимулирующий эффект и обусловливают формирование первичного и вторичного иммунного ответа у лабораторных животных. При этом иммунозоли, обеспечивающие выработку большего количества специфических антител к вирусным и бактериальным компонентам вакцины, эффективнее масляного адъюванта и гидроокиси алюминия.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. О р л я н к и н  Б.Г.,  А л и п е р  Т.И.,  Н е п о к л о н о в  Е.А.. Инфекционные респираторные болезни свиней. Ветеринария, 2005, 11: 3-6.
Иммуногенетика и искусственные антигены /Под ред. Р.В. Петрова. М., 1988.
2. М е д у н и ц ы н  Н.В. Вакцинология. М., 2004.
Биотехнология /Под ред. Е.С. Воронина. СПб, 2005.
3. С е р г е е в  В.А.,  Н е п о к л о н о в  Е.А.,  А л и п е р  Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М., 2007.
4. L i n d b l a d  E.B. Aluminium adjuvants — in retrospect and prospect. Vaccine, 2004, 22: 3658-3668.
5. Биотехнология клеток животных. Т. 1, 2 /Под ред. Г.А. Сафонова. М., 1990: 138-287.
6. М е р т в е ц о в  Н.П. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. Новосибирск, 1987.
7. V o n  D a l s g a a r d  K. Fortschritte im Verstandnis uber, Wirkungsweisen von Adjuvanfien In: Aus der Vaccinology Group, University of Copenhagen Vortrag anlasslich des BVD-Symposiumsder Virbac Tierarzneimittel GmbHin. Hannover, 2000: 22-24.
8. F o r g a c s  A.,  P e r e n y i  T.,  S o l y o m  F. Kontrollmethoden zur Standardisierung der Emulsionsimpfstoffe. In: Phylaxia, Virushauptabteiiung, Biochemische Abteilung. Budapest, 2001: 46-52.
9. К а п л у н  А.П.,  Л е  Б а н г  Ш о н,  К р а с н о п о л ь с к и й  Ю.М. и др. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. М., 2005.
10. A u c o u t u r i e r  J.,  G a n n e  V. Адъюванты для ветеринарных вакцин. www.seppic.com., Р/2089/GB/01/ 2002.
11. L e v a l  A.,  G a n n e  V.,  A u c o u t u r i e r  J. MONTANIDE IMS ? новая линия адъювантов для вакцин и препаратов для инъекций. www.seppic.com., Р/0891/GB/03/2002.
12. Т р о ц е н к о  Н.И.,  Б е л о у с о в а  Р.В.,  П р е о б р а ж е н с к а я Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. М., 1999.
13. Л а к и н  Г.Ф. Биометрия. М., 1968: 17-253.

 

ANTIGENIC ACTIVITY OF VACCINE AGAINST INFECTIOUS DISEASES IN PIGS AT THE ADDITION OF ADJUVANT TO THEIR COMPOSITION

E.V. Shemel’kov, Yu.N. Fedorov, O.A. Verkhovskii

In the experiments on laboratory animals the authors made the comparative assessment of the influence of different adjuvant’s types on antigenic activity of vaccine preparations against infectious diseases in pigs. It was shown, that the most effectiveness belongs to immunosols, which produce the bigger amount of specific antibodies to viral and bacterial vaccine components than oil adjuvant and aluminum hydrate.

Key words: adjuvant, immune response, antibodies, immunosol, laboratory animals, antigen activity.

ЗАО «НПО НАРВАК», 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 16; ГНУ Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, 109428 г. Москва, Рязанский просп., 24, корп. 1; АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных», 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 16, e-mail: verkhovsky@rosvet.ru, info@dpri.ru

Поступила в редакцию 19 декабря 2007 года

 

Оформление электронного оттиска

От эксперимента — к практике Всероссийский НИИ селекции и семеноводсва овощных культур Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Всероссийский НИИ cельскохозяйственной биотехнологии РАСХН Биотехнический научно-экспериментальный комплекс "ГосНИИсинтезбелок"