Сельскохозяйственная биология, 2008, № 4, с. 53-57.

УДК 636.2:591.39

РЕКОНСТРУИРОВАНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ДОНОРОВ ЯДЕР СВЕЖЕРАЗМОРОЖЕННЫХ ФЕТАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

М.И. ПРОКОФЬЕВ, О.И. СТЕПАНОВ, А.В. КОМИССАРОВ, Т.А. АНТИПОВА, М.В. ПИНЮГИНА, Г.П. МАЛЕНКО

Изучали развитие in vitro (дробление и развитие до стадии бластоцисты) клонированных эмбрионов крупного рогатого скота, реконструированных при использовании в качестве доноров ядер криоконсервированных фетальных фибробластов непосредственно после их размораживания и после дополнительного культивирования клеток.

Ключевые слова: кариопласт, цитопласт, эмбрион, реконструкция, фетальные фибробласты, крупный рогатый скот, культивирование in vitro.

Использование соматических клеток животного в качестве доноров ядер — один из приемов клонирования млекопитающих (1). При этом цитопластами наиболее часто служат зрелые ооциты, энуклеированные на стадии метафаза II, а кариопластами — соматические клетки на стадии клеточного цикла G1 или G0. Выделение популяции клеток, находящихся преимущественно на стадии G1/G0, основано на том, что при культивировании in vitro в период активного роста доля клеток на стадии G0/G1 составляет около 50 %, при достижении монослоя — более 80 %, а по истечении последующих 3-4 сут культивирования — свыше 90 % (2, 3). Кроме того, при дополнительном культивировании монослоя в течение 3-4 сут в среде с низким содержанием сыворотки крови вследствие так называемого «сывороточного голодания» происходит блокирование клеточного деления преимущественно на стадии клеточного цикла G0 (2, 4). Клетки на стадии G1 получают, разделяя пары, объединенные цитоплазматическим мостиком после завершения кариокинеза в митозе (5, 6). Как правило, при клонировании выделяют первичную культуру, клетки размножают и криоконсервируют с последующим размораживанием и культивированием in vitro для применения в качестве кариопластов.

Целью нашего исследования была оценка возможности получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота (КРС) при использовании в качестве доноров ядер криоконсервированных фетальных фибробластов непосредственно после размораживания.

Методика.Использовали реактивы фирмы «Sigma-Aldrich» (США). При обработке соматических клеток, ооцитов и реконструкции эмбрионов применяли модифицированную среду Тироде TLP-HEPES (Tyrode-Lactate-Pyruvate-HEPES) (7) (pH 7,2-7,4, осмотическое давление — 270-280 mOsmol), содержащую 1 мМ L-глутамина (среда T-0). Для разных этапов клонирования в среду TLP-HEPES добавляли поливинилалкоголь (PVA, 0,01 %; среда T-PVA), сыворотку крови (10 %, среда T-10) или бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin — BSA, 1 или 30 мг/мл; среда T-BSA).

Электрослияние проводили в растворе, содержащем 0,27 M D-ман-нитола, 0,1 мM MgCl2, 0,5 мM HEPES, 0,05 % BSA (pH 7,3).

Раствор маннитола, среду TLP-HEPES и ее модификации после приготовления фильтровали (диаметр пор 0,22 мкм) и хранили при -20 °С, среду SOF (8) для культивирования эмбрионов — при 4 °С. Для приготовления растворов и сред использовали воду, очищенную на установке Milli Q («Millipore», США).

Обработку ооцитов и реконструирование эмбрионов выполняли при комнатной температуре.

Яичники коров доставляли после убоя животных на мясокомбинате в течение 3-6 ч в физиологическом растворе при температуре 25-28 °С. Ооциты выделяли из фолликулов диаметром 2-8 мм при помощи специального устройства (9). Ооциты с многослойным компактным кумулюсом помещали для созревания в среду 199 с добавлением 2 мM глутамина, 0,66 мM Na-пирувата, 5 ЕД/мл гонадотропина хорионического («Московский эндокринный завод», Россия), 5 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона (препарат ФСГ-супер, ООО «Агробиомед», Россия), 1 мкг/мл эстрадиола-17?, 0,1 мM цистеамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10 % эстральной сыворотки крови КРС (ЭСК) и инкубировали при 39 °С в увлажненной атмосфере воздуха с добавлением 5 % СО2 в течение 15 ч.

Клетки кумулюса удаляли при помощи Vortex в 0,1 % растворе гиалуронидазы. Zona pellucida удаляли в растворе проназы (2 мг/мл) в среде Т-10 в течение 2 мин при температуре 39 °С. Ооциты с первым полярным тельцем (polar body 1 — PB1) отбирали для проведения энуклеации, остальные возвращали в среду дозревания и периодически просматривали для отбора появляющихся ооцитов с PB1. 

Ооциты без zona pellucida энуклеировали «слепым» методом (10) в среде T-10 на микроманипуляторе. При помощи микропипетки с ровно обрезанным краем диаметром 20-25 мкм аспирировали направительное тельце с небольшим количеством прилегающей цитоплазмы. Полученные цитопласты помещали в среду дозревания и инкубировали в тех же условиях до использования.

В качестве доноров ядер использовали фетальные фибробласты КРС, выделенные из тканей 45-суточного плода. Клетки культивировали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, ДМЕМ) с 10 % фетальной сыворотки крови КРС (ФСК), 50 мкг/мл гентамицина и 5,6 мкг/мл амфотерицина B. Первичная культура фибробластов плода в течение 4-5 сут формировала монослой. Фетальные фибробласты 3-го и 4-го пассажей по достижении не менее 80 % конфлюентности криоконсервировали с использованием замораживателя в среде ДМЕМ, содержащей 15 % ФСК и 10 % диметилсульфоксид.

При использовании фетальных фибробластов в качестве доноров ядер (непосредственно после размораживания) клетки оттаивали и суспендировали в среде Т-10. В качестве контроля прошедшие криоконсервацию клетки были разморожены, посеяны и культивировались в течение 5-6 сут без пересева и замены среды. Монослой клеток снимали 0,05 % раствором трипсина в 0,02 % растворе версена. В виде суспензии клетки находились не более 2 ч.

Подготовку пар цитопласт—фетальный фибробласт выполняли вручную при помощи пипетки диаметром 200-250 мкм под стереомикроскопом в растворе фитогемагглютинина (50 мкг/мл) в среде T-PVA и оставляли в этом растворе на 5 мин (11). Полученные конструкции переносили в камеру для электрослияния с двумя параллельными электродами, находящимися на расстоянии около 1 мм, заполненную средой для электрослияния.

Пары ориентировали таким образом, чтобы плоскость соприкосновения клеточных мембран располагалась параллельно электродам. Для электрослияния на конструкции действовали одиночным импульсом постоянного тока (1800 В/cм в течение 20 мкс), после чего их помещали в микрокапли среды T-10 под минеральным маслом. Контроль электрослияния осуществляли через 10-15 мин, слившиеся конструкции возвращали в среду дозревания.

Для активирования конструкции вначале инкубировали в течение 4 мин при температуре 39 °С в среде T-BSA (1 мг/мл), содержащей 5 мкМ иономицина. Действие иономицина ингибировали, помещая конструкции в среду Т-BSA (30 мг/мл). Затем продолжали активирование при инкубировании конструкций в среде TALP-Fert (7) в присутствии 2 мM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) в течение 4 ч при 39 °С в увлажненной атмосфере воздуха с добавлением 5 % СО2  (12).

Культивирование эмбрионов проводили в среде SOF с добавлением 5 % ЭСК в 4-луночном планшете по системе WOW (the well of the well) (13). Реконструированные эмбрионы размещали по одному в микролунки заранее подготовленного планшета и инкубировали при температуре 39 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2, 5 % О2 и 90 % N2 при максимальном увлажнении.

Дробление эмбрионов оценивали через 42-48 ч после активирования, развитие до стадии бластоцисты — через 8,5 сут.

Результаты. В обоих вариантах опыта при подготовке пар в качестве кариопластов отбирали небольшие округлые клетки без шероховатостей. Практически все пары сливались в течение 15 мин после электроимпульса.

В работах по реконструированию эмбрионов млекопитающих, как правило, необходимые для успешного электрослияния клеток точная ориентация конструкций и тесный контакт на участке соприкосновения клеточных мембран достигаются действием переменного электрического поля (явление диэлектрофореза) (14). В наших опытах переменное электрическое поле не использовали и конструкции ориентировали вручную. По-видимому, фитогемагглютинин обеспечивает создание контакта между мембранами клеток на участке их соприкосновения. Кроме того, высокая эффективность электрослияния в обоих вариантах опыта косвенно может свидетельствовать о жизнеспособности клеток, использованных в качестве кариопластов.

По частоте дробления реконструированных эмбрионов в обоих вариантах (использование в качестве кариопластов свежеразмороженных и дополнительно культивированных фетальных фибробластов) были получены близкие результаты, до стадии бластоцисты при этом развивалось около 30 % реконструированных эмбрионов (табл.).

Показано, что режим криоконсервации клеток — доноров ядер существенно влияет на эффективность реконструирования эмбрионов даже при кратковременном культивировании после размораживания. Так, эффективность электрослияния при использовании фибробластов кожи, прошедших непрограммируемое замораживание, оказалась примерно в 2 раза ниже, чем в варианте с регулируемым понижением температуры (15).

Такое же соотношение отмечено по показателю развития реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты. По данным электронной микроскопии, непрограммированное замораживание вызывает значительные структурные повреждения мембран клеток, из чего авторы заключают, что такие повреждения при криоконсервировании клеток — доноров ядер в последующем влияют на ключевые этапы реконструирования эмбрионов — эффективность электрослияния, дробление и развитие до стадии бластоцисты (15). В то же время при замораживании клеток кумулюса, полученных после сывороточного голодания, в режиме постепенного непрограммируемого охлаждения до -70 °С с последующим хранением при этой температуре в течение 2 сут целостность их мембран не нарушается, а эффективность электрослияния и развитие реконструированных с использованием этих клеток эмбрионов до стадии бластоцисты такие же, как при применении в качестве кариопластов клеток кумулюса, не подвергавшихся замораживанию (16). Наши данные согласуются с результатами последней работы, хотя мы использовали в качестве кариопластов фетальные фибробласты, длительное время (около 3 лет) хранившиеся в жидком азоте.

В наших экспериментах в течение 10-15 мин после одиночного электроимпульса сливалось практически 100 % конструкций (независимо от способа подготовки криоконсервированных фетальных фибробластов — дополнительного культивирования in vitro  или  использования непосредственно после  размораживания). Показатели частоты  дробления и развития до стадии бластоцисты по вариантам также практически не различались (см. табл.).

Мы не проводили специального исследования жизнеспособности клеток, прошедших криоконсервацию, однако размороженные клетки после посева быстро прикреплялись к подложке, распластывались и возобновляли клеточный цикл (за исключением незначительной части предположительно погибших, которые оставались во взвеси). Полученные результаты в совокупности могут свидетельствовать об отсутствии значительных повреждений фетальных фибробластов при криоконсервации в наших условиях.

Криоконсервирование фетальных фибробластов проводили по достижении монослоя не менее 80 %, когда около 80 % клеток находится на стадии G0/G1 клеточного цикла (2), то есть после оттаивания выход клеток G0/G1 составлял предположительно 80 %. При дополнительном культивировании в течение 5-6 сут (через 2-3 сут после достижения 100 % конфлюентности) суспензия, судя по данным литературы, была представлена преимущественно клетками на стадии клеточного цикла G0 (2, 3). Кроме того, в каждом из вариантов мы использовали мелкие клетки, поскольку такой размер характерен для популяции, находящейся преимущественно на стадии G0/G1 (17).

Таким образом, в качестве доноров ядер при получении клонированных эмбрионов крупного рогатого скота можно использовать криоконсервированные фетальные фибробласты непосредственно после их размораживания.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. W i l m u t  I.,  S c h m e k e  A.E.,  Mc W h i r  J. e.a. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385: 810-813.    
2. H a y e s  O.,  R a m o s  B.,  R o d r i g u e s  L. e.a. Cell confluency is as efficient as serum starvation for inducing arrest in the G0/G1 phase of the cell cycle in granulosa and fibroblast cells of cattle. Animal Reprod. Sci., 2005, 87: 181-192.   
3. L a n  G.,  C h a n g  Z.,  L u o  M. e.a. Production of cloned goats by nuclear transfer of cumulus cells and long-term cultured fetal fibroblast cells into abattoir-derived oocytes. Mol. Reprod. Develop., 2006, 73: 834-840.  
4. S h i n  M.,  P a r k  S.,  S h i m  H. e.a. Nuclear and microtubule reorganization in nuclear-transferred bovine embryos. Mol. Reprod. Develop., 2002, 62: 74-82.  
5. K a s i n a t h a n  P.,  K n o f t  J.,  W a n g  Z. e.a. Production of calves from G1 fibroblasts. Nat. Biotechnol., 2001, 19: 1176-1178.   
6. U r a k a w a  M.,  I d e t a  A.,  S a w a d a  T. e.a. Examination of a modified cell cycle synchronization method and bovine nuclear transfer using synchronized early Gl phase fibroblast cells. Theriogenology, 2004, 62: 714-728. 
7. B a v i s t e r  B.D., Y a n a g i m a c h i  R. The effects of sperm extract and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster spermatozoa in vitro. Biol. Reprod., 1977, 16: 228-237.  
8. T e r v i t  H.R.,  W h i t t i n g h a m  D.G.,  R o w s o n  L. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. Reprod. Fertil. Develop., 1972, 30: 493-497. 
9. М а л е н к о  Г.П. Устройство для выделения комплексов «ооцит-кумулюс» из антральных фолликулов яичников крупного рогатого скота. С.-х. биол., 2001, 4: 117-119.  
10. P r o k o f i e v  M.I.,  S t e p a n o v  O.I.,  K o m i s s a r o v  A.V. e.a. Blind enucleation of oocytes is highly efficient in zona-free bovine cloning. Reprod. Fertil. Develop., 2007, 19: 156-157.  
11. O b a c k  B.,  W i e r s e m a  A.T.,  G a y n o r  P. e.a. Cloned cattle derived from a novel zona-free embryo reconstruction system. Clon. Stem. Cells, 2003, 5: 3-12. 
12. S u s k o - P a r r i s h  J.L.,  L e i b f r i e d - R u t l e d g e  M.L.,  N o r t h e y  D.L. e.a. Inhibition of protein kinases after an induced calcium transient causes transition of bovine oocytes to embryonic cycles without meiotic completion. Develop. Biol., 1994, 166: 729-739.  
13. V a j t a  G.,  P e u r a  T.T.,  H o l m  P. e.a. New method for culture of zona-included or zona-free embryos: the well of the well (WOW) system. Mol. Reprod. Develop., 2000, 55: 256-264.  
14. Z i m m e r m a n  U.,  V i e n k e n  J. Electric field-induced cell-to-cell fusion. J. Membrane Biol., 1982, 67(3): 165-182. 
15. H a y e s  О.,  R o d r i g u e z  LL.,  G o n z a l e z  A. e.a. Effect of cryopreservation on fusion efficiency and in development into blastocysts of bovine cell lines used somatic cell cloning. Zygote, 2005, 13: 277-282. 
16. T a n i  T.,  K a t o  Y.,  T s u n o d a  Y. Developmental potential of cumulus cell-derived cultured cells frozen in a quiescent state after nucleus transfer. Theriogenology, 2000, 53: 1623-1629. 
17. C h o  J.,  B h u i y a n  M.,  S h i n  S. e.a. Development potential of transgenic somatic cell nuclear transfer embryos according to various factors of donor cell. Theriogenology, 2004, 66: 1567-1573. 

REINGENEERING OF CATTLE EMBRYOS WITH THE USE OF NEWLY DEFREEZED FETAL FIBROBLASTS AS NUCLEI DONORS

M.I. Prokof’ev, O.I. Stepanov, A.V. Komissarov, T.A. Antipova, M.V. Pinyugina, G.P. Malenko

The authors investigated the development in vitro (cell-division and development to the blastocyst) cloned cattle embryos reconstructed with the use as nuclei donors of cryoconservated fetal fibroblasts immediately after their defreezing and after additional cells cultivation.

Key words: karyoplast, cytoplast, embryo, reconstruction, fetal fibroblast, cattle, culture in vitro.

Оформление электронного оттиска