doi: 10.15389/agrobiology.2021.3.475rus
УДК 635.656:579.64:631.811
Исследования выполнены при финансовой поддержке РНФ (грант № 17-76-30016).
АНАЛИЗ ЭФФЕКТОВ СОВМЕСТНОЙ ИНОКУЛЯЦИИ ГРИБАМИ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ И РИЗОБИЯМИ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ ГОРОХА Pisum sativum L.
И.В. ЛЕППЯНЕН, О.Ю. ШТАРК, О.А. ПАВЛОВА, А.Д. БОВИН,
К.А. ИВАНОВА, Т.С. СЕРОВА, Е.А. ДОЛГИХ ✉
Совместная инокуляция грибами арбускулярной микоризы и азотфиксирующими бактериями порядка Rhizobiales (ризобиями) способна стимулировать рост и развитие растений. Такое влияние может быть как проявлением синергического эффекта двух микроорганизмов на растение в многокомпонентной системе, так и результатом взаимного воздействия микроорганизмов друг на друга, однако механизмы, которые лежат в основе взаимного влияния микроорганизмов, остаются недостаточно полно изученными. В представленной работе впервые показано, что при совместной инокуляции растений гороха грибами арбускулярной микоризы и ризобиями важен способ внесения микроорганизмов. При последовательной инокуляции наблюдалась конкуренция микроорганизмов за нишу в растении. Нашей целью было изучение возможности использования комбинации штаммов грибов арбускулярной микоризы Rhizophagus irregularis BEG144 и ризобий Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM 1026 для совместной инокуляции гороха посевного Pisum sativum L. У растений оценивали индукцию маркеров развития двух типов симбиоза, степень микоризации корней, а также биометрические показатели. Исследования проводили на проростках гороха сорта Frisson, выращенных в стерильных условиях. Для инокуляции использовали изолят гриба Rhizophagus irregularis BEG144. Получали инокулюм на основе микоризованных корней плектрантуса (Plecthrantus australis). Инокулюм вносили в увлажненный субстрат перед посадкой проростков гороха. Через 7 сут после посадки в систему вносили штамм ризобий Rhizobiumleguminosarum bv. viciae RCAM 1026. Схема опыта включала следующие варианты: без инокуляции (контроль), R. leguminosarum (Rlv),R. irregularis(АМ), R. irregularis + R. leguminosarum (АМ + Rlv). Через 9 и 21 сут после посадки (через 2 и 14 сут после бактериальной инокуляции) собирали материал для анализа экспрессии генов — маркеров развития бобово-ризобиального симбиоза. На 21-е сут после посадки проводили сбор растений с целью определения их биометрических параметров, а также контроля развития симбиозов. Боковые корни обрезали и замораживали в жидком азоте. После выделения суммарной РНК синтезировали кДНК на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы с использованием олиго(дT) праймеров и проводили анализ методом количественной ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (CFX96 Real-Time, «Bio-Rad Laboratories», США). Было показано, что общая масса растений и масса корневой системы достоверно (р < 0,05) повышались при инокуляции Rlv, АМ и АМ+ Rlv по сравнению с контрольным вариантом. Однако достоверных различий по этим биометрическим показателям между вариантом с Rlv или АМ и двойной инокуляцией выявлено не было. Вероятно, при последовательной инокуляции несколькими эндосимбионтами между ними возникала конкуренция на стадии проникновения в растение, что приводило к уменьшению интенсивности инфекции растений ризобиями. Об этом свидетельствовал тот факт, что при двойной инокуляции отсутствовала дополнительная стимуляция экспрессии генов Enod5 и Sym37, которые активируются у растения в процессе развития ризобиальной инфекции. При двойной инокуляции мы также не выявили дополнительной стимуляции экспрессии маркерных генов симбиоза с грибами АМ — PT4, TI,RAM1 и DELLA3. Полученные данные не позволяют сделать вывод о положительном влиянии двойной инокуляции на рост и развитие растений гороха при использованной схеме внесения микроорганизмов. Результаты могут указывать на наличие конкуренции микроорганизмов за нишу в растении, приводящей к снижению внутрикорневой микоризной колонизации и степени индукции маркеров, которые активируются в процессе развития ризобиальной инфекции.
Ключевые слова: растительно-микробные взаимодействия, ризосфера, симбиоз, арбускулярная микориза, ризобии, Rhizophagus irregularis, экспрессия генов, Pisum sativum.
I.V. Leppyanen, O.Y. Shtark, O.A. Pavlova, A.D. Bovin, K.A. Ivanova, T.S. Serova, E.A. Dolgikh✉
Co-inoculation of plants with arbuscular mycorrhizal (AM) fungi and nitrogen-fixing bacteria of the order Rhizobiales (rhizobia) can have a stimulating effect on plant growth and development. This influence can be considered as the synergistic effect of two microorganisms on a plant in a multicomponent system and as the result of the mutual influence of microorganisms on each other. However, the mechanisms underlying the mutual influence of microorganisms remain insufficiently understood. In the presented work, it was shown for the first time that in the case of joint inoculation of pea plants with fungi of arbuscular mycorrhiza and rhizobia, the method of introduction microorganisms may be important. The results may indicate the presence of competition of microorganisms for a niche in the plant during sequential inoculation. The purpose of our research was to study the possibility of selection of the effective combinations of AM and rhizobia strains for inoculation of such important agricultural crop as Pisum sativum L. as well as estimation of influence on the productivity of plants. In this work, we analyzed the effects of joint inoculation of pea plants Pisum sativum L. with the fungus Rhizophagus irregularis BEG144 and the rhizobial strain R. leguminosarum bv. viciae RCAM 1026. For this purpose, the level of induction of markers development of two types of symbiosis, the degree of root mycorrhization were assessed, as well as the biometric parameters of plants. The research was performed using pea seedlings of the cultivar Frisson grown under sterile conditions. The isolate of the fungus Rhizophagus irregularis BEG144 was used for inoculation. An inoculum was obtained from the mycorrhized roots of Plecthrantus australis. The inoculum was introduced into a moisture substrate before planting the pea seedlings. The scheme of sequential inoculation was used, according to which pea plants were first inoculated with AM fungi R. irregularis BEG144 and 7 days after cultivation, the rhizobial strain Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM 1026 were introduced into the system. The experimental scheme included the following options: without inoculation (control), R. leguminosarum (Rlv), R. irregularis (AM), R. irregularis + R. leguminosarum (AM + Rlv). 9 and 21 days after planting (2 and 14 days after bacterial inoculation), the material was collected to analyze the expression of genes - markers of the legume-rhizobial symbiosis development. On day 21 after planting, the plants were collected in order to determine their biometric parameters, as well as the markers of the symbiosis development. The lateral roots of the plants were cut off and frozen in liquid nitrogen. After isolation of the total RNA, cDNA was synthesized on the RNA template using reverse transcriptase using oligo(dT) primers. For the analysis, quantitative PCR combined with reverse transcription (RT-PCR) was performed (a CFX96 Real-Time instrument, «Bio-Rad Laboratories», USA). The total weight of plants and the weight of the root system significantly increased in case of monoinoculation with rhizobia, monoinoculation with AM fungi, as well as joint inoculation, compared with the control variant. However, no significant differences in these biometric parameters between the variant with monoinoculation with rhizobia or AM fungi and double inoculation were found. Probably, upon inoculation with several endosymbionts, competition arose between them at the stage of penetration into the plant, which led to a decrease in the intensity of plant infection with rhizobia. This was evidenced by the absence of additional stimulation of the Enod5 and Sym37 gene expression during double inoculation, which are activated in the plant during the development of rhizobial infection. Upon double inoculation, we also did not reveal additional stimulation of the expression of marker genes of symbiosis with AM fungi — PT4, TI, RAM1 and DELLA3. This correlated with the absence of significant differences in all biometric parameters between the variant with monoinoculation with rhizobia or AM fungi and double inoculation, which does not allow us to conclude about the positive effect of double inoculation on the growth and development of pea plants under the conditions of this experiment. The results of data analysis using the experimental scheme used may indicate the presence of competition of microorganisms for a niche in the plant, leading to a decrease in intra-root mycorrhizal colonization and the level of induction of markers that are activated during the development of rhizobial infection.
Keywords: plant-microbe interactions, rhizosphere, symbiosis, arbuscular mycorrhiza, inoculation, rhizobia, Rhizophagus irregularis, gene expression, Pisum sativum.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
