doi: 10.15389/agrobiology.2021.3.602rus
УДК 581.19:581.143.6
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.
ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ МЕТА-ХЛОРБЕНЗГИДРИЛМОЧЕВИНЫ
И.Ф. ГОЛОВАЦКАЯ ✉, А.Е. РЕЗНИЧЕНКО, Н.И. ЛАПТЕВ
Мета-хлорбензгидрилмочевина (МХБМ) — индуктор монооксигеназной системы человека, ключевые ферменты которой относятся к суперсемейству цитохромов Р-450 (CYP). В настоящее время отсутствуют сведения о роли МХБМ в регуляции жизнедеятельности растений, однако показано участие CYP в превращении вторичных метаболитов, например флавоноидов (Фл), и большинства фитогормонов. Горькуша оргадаай (Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) — малоизученный вид растений. Ее клеточная культура, в соответствии с нашими данными, 2-кратно увеличивает суммарное количество эндогенных Фл при переходе от экспоненциального роста в стационарную фазу. В настоящем исследовании впервые показаны статистически значимые (p ≤ 0,05) различия в ответных ростовых реакциях каллусной культуры S. orgaadayi на действие МХБМ в разных концентрациях. Выявлено, что изменение ростового индекса по сырой и сухой массе обусловлено изменением объема и формы клеток, а также частоты встречаемости разных групп клеток. Впервые исследована динамика содержания флавоноидов, сопровождающая изменения роста культуры под влиянием МХБМ. Целью работы было определение роли мета-хлорбензгидрилмочевины в накоплении флавоноидов и изменчивости цитоморфологических характеристик (линейных размеров, объема и формы клеток, частоты встречаемости разных групп клеток, ростового индекса по сырой и сухой биомассе каллуса) каллусной культуры горькуши оргадаай. Каллусную культуру, полученную на основе семядольных эксплантов из стерильных проростков, многократно пассировали на модифицированной агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением сахарозы, витаминов и регуляторов роста (0,8 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,5 мг/л 6-бензинаминопурина). Культуру выращивали в темноте при температуре 22-24 °С на среде МС с добавлением регуляторов роста и МХБМ (ООО «Синтегал», Россия) в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10; 100 мкМ. В контроле МХБМ не вносили. Продолжительность субкультивирования составила 30 сут, 2/3 растительного материала использовали для определения сырой и сухой биомассы с последующим выделением флавоноидов, 1/3 материала фиксировали в растворе Кларка в течение 2 сут. Для приготовления микропрепаратов каллусную культуру мацерировали в 3 н. растворе соляной кислоты при постоянном встряхивании до получения однородной суспензии клеток. Цитофотометрический анализ осуществляли с помощью световой микроскопии (видеокамера Moticam 2300, «Motic», Испания) с программным обеспечением. Определяли размеры 100 клеток для каждого варианта, оценивали их форму, вычисляли объем. Для расчета ростового индекса (РИ) определяли начальную (начало субкультивирования, М0) и конечную сырую или сухую массу каллусов (на 30-е сут субкультивирования, М30) и выражали в процентах к контролю: РИ = (М30 - М0)/М0. Количественное определение содержания суммы Фл в каллусной культуре осуществляли на основе их комплексообразования с хлоридом алюминия и последующего измерения оптической плотности окрашенных растворов (спектрофотометр UV-1650, «Shimadzu Corp.», Япония). В результате исследований установлено дозозависимое действие МХБМ на рост клеток за счет их деления (при 0,1 мкМ) и растяжения (1-100 мкМ), которое сопровождалось увеличением РИсыр и РИсух каллусной культуры соответственно в 2,1-3,5 и 1,5-2,9 раза (р < 0,05). При концентрации 0,1 мкМ число мелких меристематических клеток увеличивалось на 16 % относительно контроля. Одновременно усредненный объем клеток крупных размеров уменьшался на 31 % по сравнению с контролем, что указывало на торможение процессов растяжения клеток. С повышением концентрации МХБМ повышалась частота встречаемости клеток среднего (на 55 и 30 % соответственно при 1 и 10 мкМ) и крупного (на 50 и 57 % при 1 и 100 мкМ) размеров и увеличивался объем крупных (на 61 % при 10 мкМ) и мелких (на 18 % при 100 мкМ) клеток относительно контроля. МХБМ на 80-95 % (р < 0,05) уменьшала суммарное количество эндогенных флавоноидов при активации ростовых процессов в клетках S. orgaadayi in vitro. Содержание суммы Фл максимально снижалось при 0,01 и 0,1 мкМ МХБМ и не имело значимых отличий от контроля при 100 мкМ МХБМ. Максимальное 3,5-кратное увеличение РИсыр, отмеченное на среде с 1 мкМ МХБМ, происходило на фоне снижения суммы Фл на 83 %. Препарат МХБМ можно использовать в растительной биотехнологии в качестве модулятора роста клеток каллусных культур за счет снижения содержания ингибирующих рост метаболитов. Для активации клеточного деления наиболее предпочтительна доза 0,1 мкм МХБМ, тогда как для изменения содержания Фл, 2-кратно увеличивающих биомассу культуры, следует применять 100 мкМ МХБМ.
Ключевые слова: Saussurea orgaadayi, клеточная культура, мета-хлорбензгидрилмочевина, морфогенез, флавоноиды.
I.F. Golovatskaya ✉, A.E. Reznichenko, N.I. Laptev
Meta-chloro-benzhydryl urea (m-СBU) is an inducer of the human monooxygenase system, its key enzymes belong to the cytochrome P-450 superfamily (CYP). Currently, there is no information about the role of m-СBU in the plant vital activity regulation; however, the participation of CYP in the metabolism of secondary metabolites, for example, flavonoids (Fl), and most phytohormones have been shown. Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob. is a poorly studied plant species. Its cell culture, in accordance with our data, doubles the total amount of endogenous Fl during the transition from exponential growth to the stationary phase. The present study, for the first time shows statistically significant (p < 0.05) differences in the growth responses of the callus culture of the S. orgaadayi to m-СBU in different concentrations. It was revealed that the change in the growth index in terms of fresh and dry weight is related to a change in the volume and shape of cells, as well as the occurrence frequency of different groups of cells. Here, for the first time, the dynamics of the content of Fl, accompanying changes in the growth of culture under the influence of m-СBU was assessed. The aim of this work was to determine the role of meta-chloro-benzhydryl urea in the accumulation of flavonoids and the variability of cytomorphological characteristics of S. orgaadayicallus culture (cell linear dimensions, volume and shape, the frequency of cells of different sizes, growth index for the fresh and dry biomass). A callus culture derived from cotyledon explants of sterile seedling was repeatedly passaged on a modified Murashige-Skoog (MS) agar nutrient medium supplemented with sucrose, vitamins and growth regulators 0.8 mg/l 2,4-D and 0.5 mg/l 6-BAP. The culture was grown in the dark at a temperature of 22-24 °С in MS medium added with growth regulators and 0.01, 0.1, 1, 10, or 100 μM m-СBU (Sintegal, LLC, Russia). In the control, m-СBU was not added. After 30 days of subculture, 2/3 of the material was used to determine the wet and dry biomass followed by the isolation of flavonoids, and 1/3 of the material was fixed in Clark’s solution for 2 days. To prepare micropreparations, the cell culture was macerated in a 3 N hydrochloric acid solution with constant shaking until a homogeneous cell suspension was obtained. Cytophotometric analysis was performed using light microscopy (video camera Moticam 2300, Motic, Spain) with software. The sizes of 100 cells were measured for each variant, their shape was estimated, and the volume was calculated. To calculate the growth index (GI), the initial (beginning of subcultivation, M0) and the final fresh or dry weight of calli (on day 30 of subculture, M30) were determined and expressed as a percentage of the control: GI = (M30 – M0)/M0. The total amount of Fl in the callus culture was quantified based on the colored Fl complexation with aluminum chloride followed by measurement of the optical density (a UV-1650 spectrophotometer, Shimadzu Corp., Japan). As a result of the studies, a dose-dependent effect of m-СBU on cell growth was established due to their division (0.1 μM) and stretching (1-100 μM), which was accompanied by a 2.1-3.5-fold and 1.5-2.9-fold increase in the GIf and GId of callus culture, respectively (p < 0.05). At a concentration of 0.1 μM, the number of small meristematic cells increased by 16 % compared to the control. At the same time, the average volume of large cells decreased by 31 % as compared to the control, which indicates inhibition of cell elongation processes. With the increase in m-СBU concentration, the frequency of cells of two groups increased, by 55 and 30 % for medium-sized cells at 1 and 10 μM, respectively, and by 50 and 57 % for large-sized cells at 1 and 100 μM, respectively. The volume of cells also increased compared to the control, by 61 % at 10 μM for large cells and by 18 % at 100 μM of small cells. m-СBU reduced the total amount of endogenous flavonoids by 80-95 % (p < 0.05) upon activation of growth processes in S. orgaadayi cells in vitro. The content of the total Fl decreased maximally at 0.01 and 0.1 μM m-СBU and did not differ significantly from the control at 100 μM m-СBU. The maximum 3.5-fold increase in GIf in the medium with 1 μM m-СBU occurred simultaneously with an 83 % decrease in the amount of Fl. m-СBU can be used in plant biotechnology as a cell growth modulator in callus cultures to reduce the content of growth-inhibiting metabolites. To activate cell division, the most preferable dose is 0.1 µM m-СBU, while to change the content of Fl, which doubles the biomass of the culture, 100 µM m-СBU should be used.
Keywords: Saussurea orgaadayi, cell culture, meta-chloro-benzhydryl urea, morphogenesis, flavonoids.
ФГАОУ ВО Национальный исследовательский |
Поступила в редакцию |
