doi: 10.15389/agrobiology.2020.3.533rus
УДК 633.18:575:57.085.23
Работа поддержана Программой совместной лаборатории Китая, стран СНГ и Центрально-Восточной Европы в рамках стратегии «Один пояс, один путь» (№ 2016AE6AE001).
ВНУТРИКАЛЛУСНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ
РИСА, ПОЛУЧЕННЫХ В АНДРОГЕНЕЗЕ in vitro
М.В. ИЛЮШКО1, М.В. РОМАШОВА1, J.-M. ZHANG2, L.-W. DENG3,
D.-J. LIU4, R. ZHANG2, С.С. ГУЧЕНКО1
Андрогенез in vitro — один из ведущих методов при создании исходного материала для селекции сельскохозяйственных культур. Многие селекционеры считают семенное потомство любого удвоенного гаплоида новой линией вне зависимости от того, с какого каллуса она получена. Однако в полевых условиях линии с одного каллуса часто выглядят одинаково и выбраковываются. Известно около 100 генов устойчивости к грибному возбудителю пирикуляриоза риса Pyricularia oryzae Cav. [Magnaporthe grisea (Hebert Barr.)]. В число наиболее актуальных генов для российского Дальнего Востока входят Pi-ta и Pi-ta2. В настоящей работе впервые выявлен внутрикаллусный морфологический полиморфизм и генетическая вариабельность удвоенных гаплоидов риса Oryza sativa L., полученных в андрогенезе in vitro гибридного растения, по генам устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta и Pi-ta2 вследствие гаметоклональной и сомаклональной изменчивости. Впервые среди удвоенных гаплоидов одной каллусной линии продемонстрирована мономорфность (отсутствие генетической вариабельности), обусловленная клональным размножением (митотическим делением) клеток каллуса. Целью нашей работы было изучение внутрикаллусной морфологической и генетической изменчивости удвоенных гаплоидов риса Oryza sativa L., полученных в андрогенезе in vitro гибридного растения. Опыты проводили в ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки (Россия) и Институте селекции зерновых культур Хейлунцзянской академии сельскохозяйственных наук (Китай) в 2017-2018 годах. В качестве исходного растения для получения удвоенных гаплоидов риса использовали гибрид F1 сортов Дон 4237 × Долинный. Сорт Долинный служит носителем аллелей генов Pi-ta и Pi-ta2, определяющих устойчивость к пирикуляриозу. В культуру in vitro было введено 386 гибридных пыльников. Каллусообразование составило 17,1 %. Сформировалось 18 каллусных линий с зелеными регенерантами, из которых для эксперимента отобрали шесть. По два семени каждой линии удвоенных гаплоидов высевали в почвогрунт в пластиковых стаканчиках и выращивали в условиях культуральной комнаты при 24 °С, 5000 лк и режиме 16 ч (день)/8 ч (ночь). Через 90 сут после посева одно растение срезали и определяли окраску среза (наличие/отсутствие антоцианового пигмента). Отмечали следующие фазы роста и развития растений: поздняя стадия кущения, выход в трубку, выметывание, цветение. Удвоенные гаплоиды, находящиеся на первых двух указанных стадиях, были объединены в группу поздних. Ранними считали растения, достигшие фазы выметывания и цветения. После созревания отмечали дискретные признаки: наличие или отсутствие остей, их длину и окраску. ДНК выделяли из свежих листьев СТАВ-методом. Качество и количество ДНК определяли методом электрофореза в 1,0 % агарозном геле. Аллели генов Pi-ta и Pi-ta2, определяющие устойчивость к пирикуляриозу, выявляли методом полимеразной цепной реакции. В качестве позитивного контроля для гена Pi-ta использовали растения китайского моногенного сорта K12, для гена Pi-ta2 — сорта K27. Установлено, что удвоенные гаплоиды двух каллусных линий 7.2.2 и 21.2.1 были мономорфными, без генетической изменчивости по обоим генами устойчивости Pi-ta и Pi-ta2. Семена растений каждой каллусной линии 7.2.2 и 21.2.1 в дальнейшем будут объединены в две отдельные селекционные линии, а большее число семян позволит интенсифицировать селекционный процесс. Среди удвоенных гаплоидов четырех других изученных каллусных линий (1.2.1, 4.1.2, 8.2.1 и 36.2.3) нами выявлен полиморфизм по остистости, скорости развития растений и антоциановой окраске среза. У каллусной линии 8.2.1 обнаружена генетическая изменчивость: 10 растений несли аллели устойчивости по обоим генам (Pi-ta и Pi-ta2), 8 растений не имели ни одного аллеля, у 26 растений был детектирован только определяющий устойчивость аллель гена Pi-ta2. Таким образом, при каллусообразовании в андрогенезе in vitro происходят два разнонаправленных процесса. Первый — это хорошо изученная сомаклональная изменчивость, которая ведет к полиморфизму клеток и регенерантов у растений. Второй представляет собой клонирование клеток, обусловливающее внутрикаллусное единообразие части регенерантов, а во многих случаях — всех регенерантов, полученных от одного пыльника. Мономорфные удвоенные гаплоиды после предварительной оценки по морфологическим и молекулярно-генетическим признакам составляют единый селекционный образец.
Ключевые слова: Oryza sativa, андрогенез in vitro, внутрикаллусная изменчивость, пирикуляриоз, устойчивость, Pi-ta, Pi-ta2.
INTRA-CALLUS VARIABILITY OF RICE DOUBLED HAPLOIDS GENERATED THROUGH in vitro ANDROGENESIS
M.V. Ilyushko1, M.V. Romashova1, J.-M. Zhang2, L.-W. Deng3, D.-J. Liu4, R. Zhang2, S.S. Guchenko1
In vitro androgenesis is among the leading methods in creating source material for crop breeding. Many breeders a priori consider the seed progeny of any doubled haploid a new line, regardless of which callus the line was obtained from. In practice, it often turns out that in field conditions the lines from one callus are outwardly identical, so the breeders discard them, leaving two or three of ones for further work. The validity of such a controversial approach requires experimental confirmation or refutation of polymorphism and genetic variability of doubled haploids of the same callus line. About 100 genes of rice resistance to Pyricularia oryzae Cav. [Magnaporthe grisea (Hebert Barr.)] are known of which Pi-ta и Pi-ta2 are the most relevant for the Russian Far East. This paper is the first to report intracallus morphological polymorphism and genetic variability for Pi-ta и Pi-ta2 genes due to gametoclonal and somaclonal variability of rice Oryza sativa L. doubled haploids derived from a hybrid plant via in vitro androgenesis. For the first time, a monomorphism in the absence of genetic variability due to callus cell clonal reproduction (mitotic division) was revealed among doubled haploids produced by the same callus line. Our work aimed to study the intracallus morphological and genetic variability of Oryza sativa L. doubled rice haploids derived in vitro androgenetically from a hybrid plant. Experiments were performed in 2017-2018 at the Federal Research Center of Agricultural Biotechnology of the Far East (Russia) and the Crop Resources Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, (China). A F1 Don 4237 ½ Dolynniy rice hybrid was used. A total of 386 anthers of this hybrid were cultured in vitro with the callus formation rate of 17.1%. Six of eighteen callus lines producing green regenerants were selected for further study. Two seeds of each doubled haploid line were sown in soil and grown in plastic pots (a culture room, 24 °С, 5000 lux, 16 hours/8 hours day/night). One plant of each pair was cut 90 days after sowing to assess the presence/absence of anthocyanin coloration. Plant growth stages (late tillering, stem extension, heading, and flowering) were recorded. Doubled haploids that reached the first two of these stages were assigned to a later group, and those that reached the heading and flowering stages were combined into an early group. The presence or absence of awns, their length and color were estimated after maturation. DNA was extracted from fresh leaves by CTAB method. The DNA quality and quantity were estimated electrophoretically using a 1.0 % agarose gel. Alleles of the Pi-ta and Pi-ta2 genes which determine blast resistance were detected by PCR method. Plants of the Chinese monogenic variety K12 were a positive control for Pi-ta gene, and varieties K27 for Pi-ta2 gene. The doubled haploids of two callus lines, 7.2.2 and 21.2.1, are monomorphic without genetic variability for both resistance genes, Pi-ta and Pi-ta2. Plant seeds of each callus line (7.2.2 and 21.2.1) will be further combined into two separate breeding lines to intensify breeding due to a larger number of seeds. Doubled haploids of the callus lines 1.2.1, 4.1.2, 8.2.1, 36.2.3 are polymorphic in awn formation, plant growth stage and anthocyanin pigmentation of stem cuts. The callus line 8.2.1 is genetically variable (ten plants carried alleles of both resistance genes, Pi-ta and Pi-ta2, eight plants possessed none of the alleles, and in 26 plants only Pi-ta2allele was detected). Thus, upon callus formation via in vitro androgenesis, the two opposite processes occurred are somaclonal variation and cell cloning. Somaclonal variation leads to polymorphism of callus cells and plant-regenerants, while cell cloning determines intra-callus uniformity, as well as the uniformity of some regenerants (and, in many cases, all regenerants derived from the same anther). Monomorphic doubled haploids, after a preliminary assessment for morphological traits and molecular characteristics, comprises a single selection sample.
Keywords: Oryza sativa, in vitro androgenesis, intra-callus variability, rice blast, resistance, Pi-ta, Pi-ta2.
1ФГБНУ ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока |
Поступила в редакцию |
