doi: 10.15389/agrobiology.2020.3.510rus
УДК 633:631.522/.524:575:57.06
Работа выполнена в рамках государственного задания № 0574-2019-0003.
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИНТРОГРЕССИИ ФРАГМЕНТОВ A-, B-, C-ГЕНОМОВ У ВИДОВ РОДА Brassica L. ПРИ ОТДАЛЕННОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Ю.В. АНИСКИНА1, Д.А. РОДИОНОВА1, 2, О.Н. ЗУБКО2, С.Г. МОНАХОС2,
Н.С. ВЕЛИШАЕВА1, О.С. КОЛОБОВА1, И.А. ШИЛОВ1
Род Brassica L. — источник масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур, широко выращиваемых по всему миру. Большинство культурных растений относятся к трем диплоидным видам B. rapa L. (2n = 20, геном AA), B. nigra (L.) K. Koch (2n = 16, BB) и B. oleracea L. (2n = 18, CC) и трем аллотетраплоидным видам B. juncea(L.)Czern. (2n = 36, AABB), B. napus L. (2n = 38, AACC) и B. carinata A. Braun (2n = 34, BBCC), которые возникли в результате естественной гибридизации диплоидов. Эффективным способом увеличения генетического разнообразия и улучшения агрономических признаков культур Brassica служит отдаленная гибридизация. Для контроля интрогрессии геномного материала при отдаленной гибридизации необходимо применение методов генетического маркирования. В настоящей работе предложен эффективный подход для контроля интрогрессии геномов A, B и C Brassica у растений, полученных в результате межвидовой гибридизации. Впервые выявлены специфичные для A-, B- и C-геномов Brassica микросателлитные маркеры, длина которых определена в системе высокоразрешающего электрофореза с точностью до одного нуклеотида, а также изучена возможность применения этих маркеров для анализа селекционных образцов, полученных в результате межвидовой гибридизации. Целью исследования была разработка высокопроизводительной технологии контроля интрогрессии геномов A, B и C у представителей рода Brassica при отдаленной гибридизации на основе мультиплексного микросателлитного ПЦР-анализа геном-специфичных микросателлитных маркеров. В качестве контрольных образцов исследовали растения, полученные из Центра генетических ресурсов CGN (Centre for Genetic Resources, Нидерланды) и Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР, г. Санкт-Петербург). Растительный материал для анализа интрогрессий был предоставлен сотрудниками ООО Селекционная станция им. Н.Н. Тимофеева (г. Москва). Геномную ДНК получали методом адсорбции на сорбенте. ДНК амплифицировали в ПЦР с праймерами, специфичными для локусов Na10-D09, Na12-A02, Na12-F12, Ni2-B02, Ni2-F02, Ni3-G04B, Ol12-A04, Ra2-E12, BRMS-043, BN6A2. Анализ флуоресцентно меченных ПЦР-фрагментов осуществляли методом высокоразрешающего электрофореза (генетический анализатор Нанофор-05, ООО НРФ «Синтол»—ФГБНУ Институт аналитического приборостроения РАН, Россия). Длину ПЦР-фрагментов устанавливали с помощью программного обеспечения ДНК Фрагментный анализ (ФГБНУ ИАП РАН, Россия). В результате проведенного исследования разработана система для мультиплексного ПЦР-анализа на основе шести микросателлитных локусов (Na12-A02, BRMS-043, Na10-D09, Ol12-A04, Ni2-F02, BN6A2), позволяющая в одну стадию определить наличие маркеров геномов A, B и C у видов рода Brassica. Маркеры, специфичные для геномов A, B и C,были установлены в процессе мультиплексного ПЦР-анализа контрольных образцов Brassica с известной видовой принадлежностью и геномным составом: B. rapa (AA), B. nigra (BB), B. oleracea (CC), B. napus (AACC), B. juncea (AABB), B. carinata (BBCC). Длину маркерных фрагментов определили в системе высокоразрешающего электрофореза на генетическом анализаторе с точностью до одного нуклеотида. Маркеры, специфичные для генома A, выявлены в локусах Na12-A02 (178, 180 и 182 п.н.), BRMS-043 (303, 307 и 313 п.н.), Na10-D09 (283, 285, 291, 293 и 299 п.н.), для генома B — в локусах Na12-A02 (196, 198, 200, 202, 204, 212, 214 и 216 п.н.), Ol12-A04 (125, 127 и 129 п.н.), Ni2-F02 (198, 200, 202, 204 и 208 п.н.), BN6A2 (222 п.н.), для генома C — в локусах Na12-A02 (164, 168 и 170 п.н.), Ni2-F02 (164, 166, 168 и 186 п.н.). С использованием разработанной мультиплексной системы в генетических профилях образцов (Эт2 × КК)2 × Цв9, (Эт2 × КК)1, Грин × FBLM(1), JR × Агр2ки, БК × ЗМ1-1(6), БК × ЗМ1-1(8), БК и КБ, полученных в результате отдаленной гибридизации, выявлена интрогрессия фрагментов геномов A, B и/или C. Таким образом, у образцов с известной селекционной историей подтверждено наличие соответствующих геномов. Благодаря автоматизации всех этапов анализа в формате 96-луночного планшета эта технология позволяет осуществлять широкомасштабный скрининг селекционных образцов и может быть внедрена в практику как инструмент контроля интрогрессии A-, B- и C-геномного материала, а также контроля его наследования в последующих поколениях.
Ключевые слова: род Brassica, эволюционная модель U, геномы Brassica, отдаленная гибридизация, интрогрессия, микросателлитные маркеры, геном-специфичные маркеры.
Yu.V. Aniskina1, D.A. Rodionova1, 2, O.N. Zubko2, S.G. Monachos2,
N.S. Velishaeva1, O.S. Kolobova1, I.A. Shilov1
The genus Brassica L. is a source of oilseeds, vegetables, spices, fodder and ornamental crops widely cultivated around the world. The six most cultivated species of the genus Brassica comprise allotetraploid species B. juncea (L.) Czern. (2n = 36, genome AABB), B. napus L. (2n = 38, genome AACC) and B. carinata A. Braun (2n = 34, genome BBCC), which are natural hybrids of corresponding diploid species B. rapa L. (2n = 20, genome AA), B. nigra L. (2n = 16, genome BB), and B. oleracea L. (2n = 18, genome CC). An effective way to increase the genetic diversity and improve the agronomic traits of Brassica crops, such as high yields, resistance to diseases, and abiotic stresses is to introduce traits of interest by the interspecific hybridization. To control the introgression of genomic material upon the hybridization, the development and implementation of genetic markers are necessary. This paper proposes an effective approach for controlling the introgression of A, B, and C genomes of Brassica in intraspecific hybrids. The investigation aimed to develop a high-throughput technology based on multiplex PCR analysis of genome-specific microsatellite markers for controlling the introgression of A-, B-, and C-genomes in Brassica intraspecific hybrids. Control samples were obtained from the Center for Genetic Resources CGN (Netherlands) and the All-Russian Institute of Plant Genetic Resources N.I. Vavilov (VIR, St. Petersburg). Plant material for the genomic material introgression study were obtained from the Timofeev Breeding Station (Moscow). Genomic DNA was extracted by sorbent method. PCR was run with specific primers for the Na10-D09, Na12-A02, Na12-F12, Ni2-B02, Ni2-F02, Ni3-G04B, Ol12-A04, Ra2-E12, BRMS-043, BN6A2 loci. Fluorescently labelled PCR products were analyzed by high-resolution electrophoresis using a Nanofor-05 genetic analyzer (Syntol — The Institute for Analytical Instrumentation, Russia). The length of the amplified DNA fragments was determined using the DNA Fragment Analysis software (The Institute for Analytical Instrumentation, Russia). A multiplex PCR technique was developed based on the six microsatellite loci Na12-A02, BRMS-043, Na10-D09, Ol12-A04, Ni2-F02, BN6A2, allowing us to determine the markers of three Brassica genomes in one run. A, B, and C genome-specific markers were identified during multiplex PCR analysis of control samples of six Brassica species with known taxonomic attributions and genome compositions: B. rapa (AA), B. nigra (BB), B. oleracea (CC), B. napus (AACC), B. juncea (AABB), and B. carinata (BBCC). The length of marker fragments was determined by high resolution electrophoresis using a genetic analyzer with an accuracy of one nucleotide. A-genome specific markers were identified at the loci Na12-A02 (178 bp, 180 bp, 182 bp), BRMS-043 (303 bp, 307 bp, 313 bp), and Na10-D09 (283 bp, 285 bp, 291 bp, 293 bp, 299 bp). B-genome specific markers were detected at the loci Na12-A02 (196 bp, 198 bp, 200 bp, 202 bp, 204 bp, 212 bp, 214 bp, 216 bp), Ol12-A04 (125 bp, 127 bp, 129 bp), Ni2-F02 (198 bp, 200 bp ., 202 bp, 204 bp, 208 bp), and BN6A2 (222 bp). C-genome specific markers were detected at the loci Na12-A02 (164 bp, 168 bp, 170 bp) and Ni2-F02 (164 bp, 166 bp, 168 bp, 186 bp). The developed multiplex PCR system reveals introgressions of fragments of genomes A, B and C in the genetic profiles of interspecific hybrids (Et2 × KK)2 × Tsv9, (Et2 × KK)1, Green × FBLM(1), JR × Agr2ki, BK × ZM1-1(6), BK × ZM1-1(8), BK, and KB. The method also confirmed the presence of the corresponding genomes in the studied samples with a known breeding history. Due to the automation, analysis allows the large-scale screening of plant samples. The proposed technology can be used in breeding practice as a tool for controlling the introgression of A, B and C genome material upon the interspecific hybridization, as well as controlling its inheritance in subsequent generations.
Keywords: Brassica, U triangle, Brassica genomes, interspecific hybridization, introgression, microsatellites, genome-specific markers.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
