Сельскохозяйственная биология, 2018, том 53, № 3, с. 499-510.
(для цитирования)

doi: 10.15389/agrobiology.2018.3.499rus

УДК 633.11:577.21

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ в рамках выполнения гранта по Соглашению № 16-16-00097 от 27 января 2016 года.

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА DREB1 И СОЗДАНИЕ ЕГО ДНК-МАРКЕРА, ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕГО DREB1 МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ И ЕЕ
ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ

А.А. ПОЧТОВЫЙ^{1, 2}, П.Ю. КРУПИН^{1, 3}, М.Г. ДИВАШУК^{1, 3},
А.А. КОЧЕШКОВА¹, П.А. СОКОЛОВ¹, Г.И. КАРЛОВ^{1, 3}

Ген DREB кодирует транскрипционный фактор DREB (dehydration-responsive element binding), участвующий в ответе растения на засуху, засоление, высокую температуру. Транскрипционные факторы DREB при абиотическом стрессе индуцируют экспрессию множества генов, связанных с зависимой и не зависимой от абсцизовой кислоты передачей сигнала. Эволюционно многие дикорастущие виды формировались в экстремальных эколого-географических условиях, поэтому могут служить источниками новых генетических вариантов DREB для селекции пшеницы на устойчивость к стрессам. Изучение ортологов DREB у дикорастущих сородичей пшеницы позволит расширить арсенал генов, используемых для ее селекционного улучшения методами отдаленной гибридизации, а разработка и использование молекулярных маркеров дадут возможность направленно переносить эти гены в геном мягкой пшеницы. Среди всего разнообразия генов, кодирующих DREB белки, наибольший интерес представляет DREB1, который связан с устойчивостью растений к различным абиотическим факторам. Нами впервые были получены последовательности ДНК генов-ортологов DREB1 у представителей родов Thinopyrum, Dasypyrum, Pse-udoroegneria, а также разработан CAPS-маркер P18_FokI, которые позволяет различать ген пшеницы TaDREB1 и ген перечисленных видов. Проведена ПЦР с праймерами, соответствующими консервативным участкам гена DREB1, с целью амплификации фрагментов генов-ортологов DREB1 Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum, Dasypyrum villosum, Pseudoroegneria spicata, P. stipifolia, ПЦР-продукты клонированы и секвенированы. В результате получили 30 уникальных последовательностей с высокой степенью гомологии с генами TaDREB мягкой пшеницы (92-98 %). Между выявленными последовательностями установлены множественные однонуклетидные полиморфизмы, также обнаружены несколько крупных инсерций/делеций. Эти ДНК-последовательности были транслированы in silico в гипотетические аминокислотные последовательности. Все найденные нами нуклеотидные последовательности оказались способны кодировать полноценный белок, обладающий специфичным для DREB AP2 ДНК-связывающим доменом. Сравнение аминокислотных последовательностей AP2 ДНК-связывающего домена у изученных образцов показало наличие полиморфизмов по отдельным аминокислотам. Во всех гипотетических аминокислотных последовательностях, кроме одной, были выявлены консервативные для AP2-домена DREB-белков злаков аминокислоты. Нами создан CAPS-маркер P18_FokI, который в большинстве случаев позволяет различать гены-ортологи DREB1 пшеницы и дикорастущих злаков благодаря наличию полиморфизмов по сайтам рестрикции; фрагмент, амплифицируемый с генома мягкой пшеницы, имеет размер около 570 п.н. Ген-ортолог DREB1 был локализован в третьей гомеологичной группе Th. elongatum 3Je с использованием P18_FokI и серии дополненных линий мягкой пшеницы с хромосомами Th. elongatum. Анализ 10 пшенично-пырейных гибридов выявил наличие как TaDREB мягкой пшеницы, так и гена-ортолога DREB1 пырея у всех исследуемых образцов. При этом у образцов мягкой пшеницы с замещенной хромосомой 6J(6D) фрагмент пырейного типа отсутствовал, что также служит доказательством локализации гена-орто-лога DREB1 пырея в третьей гомеологичной группе. Таким образом, созданный нами CAPS-маркер P18_FokI позволяет эффективно переносить ген-ортолог DREB1 из дикорастущих злаков в геном мягкой пшеницы, благодаря чему можно изучить влияние чужеродного DREB1 гена на устойчивость мягкой пшеницы к засухе, засолению, низким температурам и в перспективе отобрать ценные формы методами маркер-опосредованной селекции.

Ключевые слова: Triticum, мягкая пшеница, пырей, псевдорогнерия, дазипирум, гены устойчивости, гены-ортологи, засуха, засоление, DREB1, DREB, TaDREB1, полимеразная цепная реакция, молекулярные маркеры, секвенирование.

Полный текст

CLONNING OF DREB1 GENE IN WHEAT WILD RELATIVES AND
DEVELOPMENT OF A DNA MARKER FOR ITS MONITORING IN
WHEAT BACKGROUND

A.A. Pochtovyy^{1, 2}, P.Yu. Kroupin^{1, 3}, M.G. Divashuk^{1, 3},
A.A. Kocheshkova¹, P.A. Sokolov¹, G.I. Karlov^{1, 3}

The DREB gene encodes the transcription factor DREB involved in the response of the plant to drought, salinity and heat. The DREB transcription factors induce the expression of multiple genes linked by signal transmission, abscisic acid-dependent and independent, in response to abiotic stress. Many wild species have evolved under extreme environmental conditions (drought, salinity), so they can serve as sources of new genetic variants of DREB in breeding wheat for stress resistance. The study of DREB orthologous genes in wild relatives of wheat will permit to expand the set of genes in its breeding improvement using wide hybridization, and the design and application of molecular markers will facilitate transfer of these genes into a genome of bread wheat. Among the diversity of genes encoding DREB proteins, DREB1 is of the greatest interest due to its involvement in control of plant resistance to various abiotic factors, such as drought, salinity, low temperatures. We were the first to study the DREB1 orthologs in members of the genera Thinopyrum, Dasypyrum and Pseudoroegneria. Using primers designed on the basis of DREB1 conserved regions we amplified fragments of the DREB1 orthologs in Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum, Dasypyrum villosum, Pseudoroegneria spicata, and P. stipifolia. The obtained PCR products were cloned and sequenced. As a result, 30 unique sequences were shown to be highly homologous (92-98 %) to the TaDREB genes of bread wheat. Between the sequences, we identified multiple single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and several large insertions/deletions. The resulting DNA sequences were translated in silico into hypothetical amino acid sequences. All nucleotide sequences found by us are capable of encoding a complete protein that has a DNA-binding domain specific for DREB AP2. Comparison of the amino acid sequences of the AP2 DNA-binding domain in the studied samples showed the presence of polymorphisms for individual amino acids. In all hypothetical amino acid sequences, except for one the sequence described, amino acids conserved for the DREB AP2-domain of cereals were found. We developed the CAPS marker P18_FokI, which in most cases can differentiate the DREB1 orthologs between wheat and wild relatives due to the presence of polymorphisms in the restriction sites, the fragment amplified from the genome of bread wheat has a size of about 570 bp. A DREB1 ortholog was localized in the homeological group 3 of Th. elongatum (3Je) using P18_FokI and a series of addition bread wheat lines with Th. elongatum chromosomes. Analysis of 10 wheat-wheatgrass hybrids revealed the presence of both TaDREB bread wheat and the DREB1 ortholog in all analyzed accessions. In this case, the wheat-type fragment was absent in bread wheat with a substituted chromosome 6J (6D), which also serves as a proof of localization of the DREB1 ortholog on the chromosome of homeological group 3. Thus, the CAPS marker P18_FokI developed by us helps to effectively transfer the DREB1 gene from the wild cereals to the genome of bread wheat, so that we can study the effect of the alien DREB1 gene on the resistance of bread wheat to drought, salinity, low temperatures, and, farther, to create valuable breeding forms using MAS.

Keywords: bread wheat, Triticum, Thinopyrum, Pseudoroegneria, Dasypyrum, resistance genes, orthologous genes, drought, salinity, DREB1, DREB, TADREB1, polymerase chain reaction, molecular markers, sequencing.