Сельскохозяйственная биология, 2018, том 53, № 3, с. 531-538.
(для цитирования)

doi: 10.15389/agrobiology.2018.3.531rus

УДК 633.18:631.527:581.143.6:575.2

Работа частично поддержана грантом «Программа фундаментальных исследований ДВО РАН «Дальний Восток» № 15-I-6-005.

СОДЕРЖАНИЕ ЯДЕРНОЙ ДНК У РЕГЕНЕРАНТОВ РИСА (Oryza sativa L.), ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ in vitro

М.В. ИЛЮШКО¹, М.В. СКАПЦОВ², М.В. РОМАШОВА¹

Рис — одна из важнейших продовольственных культур юга Дальнего Востока, поэтому необходимо выведение новых сортов с повышенной урожайностью и качеством зерна. В рисосеющих странах мира, в том числе в России, для ускорения селекционного процесса и создания нового исходного материала успешно применяется культура пыльников in vitro. В ней используют метод проточной цитометрии для разделения фракций регенерантов на гаплоидые, дигаплоидные и полиплоидные растения. Цитологические исследования растений в культуре клеток и тканей in vitro свидетельствуют о существовании не только геномных изменений от гаплоидов до гексаплоидов, но и хромосомных, приводящих к анэуплоидии и эндополиплоидии. В этом случае размер генома не может быть постоянной величиной. Цель работы заключалась в характеристике популяции регенерантов риса, полученных в культуре пыльников in vitro, по содержанию ядерной ДНК методом проточной цитометрии и оценке эффективности сочетания методов культуры тканей и проточной цитометрии в селекционной работе с рисом. Гибрид F₂ (УкрНИИС 3435 × Укр 96) риса посевного (Oryza sativa L. ssp. japonica Kato), полученный в Приморском НИИСХ, выращивали на вегетационной площадке в 2014 году. Перед введением в культуру in vitro пыльники риса подвергали воздействию низких положительных температур (5 °С) в течение 7 сут, поместив метелку в цилиндр с водой. Для введения в культуру пыльники помещали на индукционную питательную среду N6 c 2,4-дихлорфеноксиуксуной кислотой (2,0 мг/л). Регенеранты с развитой корневой системой пересаживали в горшочки и продолжали выращивать в условиях культуральной комнаты до образования семян. По морфологическим признакам все регенеранты (1099 шт.) разделили на пять групп: гаплоиды (стерильные растения с очень мелкими цветками); дигаплоиды (растения с семенами); тетраплоиды (растения с очень крупными немногочисленными семенами, выраженным килем и ребристостью на цветочной чешуе); растения без семян (формировали цветки нормального размера, но не образовывали семена на двух и более метелках); растения, погибшие на ранних этапах роста и развития. Содержание ДНК определяли у 176 регенерантов с использованием метода проточной цитометрии. Группа растений без семян характеризовалась высоким коэффициентом вариации по содержанию ядерной ДНК — 32 %. Сюда, вероятно, вошли растения с двойным набором хромосом, триплоиды, тетраплоиды и пентаплоиды. В этой группе наблюдалось явление эндополиплоидии. Пять растений показали двувершинность при детекции изолированных ядер в зонах гаплоидов и диплоидов, 23 растения характеризовались содержанием ядерной ДНК, близким к таковому у дигаплоидных регенерантов (в среднем 2,00 пг). Явление анеуплоидии, характерное для культуры пыльников риса in vitro, очевидно, привело к некратному изменению в хромосомных наборах, которое было несовместимо с продукцией семян. Группы дигаплоидов и тетраплоидов оказались малоизменчивы (10,5 и 5,3 %), и средние значения содержания ядерной ДНК в них составляли соответственно 1,88 и 3,75 пг. Гаплоидные растения характеризовались высокой изменчивостью (29 %) при среднем содержании ядерной ДНК 0,89 пг. Таким образом, метод проточной цитометрии можно использовать в селекции риса для выделения тетраплоидных регенерантов (в совокупности с показателем продуктивности), а также для выбраковки гаплоидов с целью исключения этапа выращивания в условиях ex vitro бесперспективных регенератов.

Ключевые слова: Oryza sariva L., культура пыльников in vitro, проточная цитометрия,  гаплоид, дигаплоид, тетраплоид.

Полный текст

NUCLEAR DNA CONTENT IN RICE (Oryza sativa L.) REGENERANTS DERIVED FROM ANTHER CULTURE in vitro

M.V. Ilyushko¹, M.V. Skaptsov², M.V. Romashova¹

Rice is an important food crop grown in the south of the Russian Far East. Therefore, breeding new varieties with high harvest and crop quality is relevant. Anther in vitro culture is successfully applied in breeding programs in rice-growing countries, including Russia. In anther in vitro culture, flow cytometry is applicable to select haploid, dihaploid and polyploid regenerants. Cytological studies show genome variations from haploids to hexaploids in plant tissue in vitro culture, and also chromosome changes which result in aneuploidy or endopolyploidy leding to an inconstant nuclear DNA content. In the work, we followed the aims i) to evaluated nuclear DNA content by flow cytometry in an androgenic rice regenerant population, and ii) to estimate the applicability of the combination of two approaches, the anther in vitro culture technique and flow cytometry, in rice breeding. A total of 1099 regenerants from in vitro anther culture of a single F₂ (UkrNIIS 3435 × Ukr 96) rice (Oryza sativa L. ssp. japonica Kato) hybrid plant were separated into four groups with regard to morphological features. Haploids were sterile plants with very small flowers, dihaploids were fertile plants, tetraploids were the plants with very few large seeds, an expressed keel and the ribbed floral scales. Also, there were the plants without seeds which flowers were normal in size but formed two or more sterile panicles. In the last group of the regenerants the plants died during early development. A total of 176 regeneranats were estimated by flow cytometry. It was revealed that nuclear DNA content varied greatly (Cv = 32 %) in the plants without seeds. This group seems to include plants with double set of chromosomes, triploids, tetraploids, and pentaploids. Additionally, in this group we found the regenerants with endopoyploidy since five of the plants had two nuclear DNA content peaks like those for haploids and diploids. In 23 plants nuclear DNA content approximated to dihaploid chromosome set and averaged 2.00 pg. Obviously, an aneuploidy characteristic of rice anther in vitro cultures could lead to aliquant changes in chromosome set in the regenerants, causing a loss of fertility. The dihaploid and tetraploid plants were low variable (Cv of 10.5 and 5.3 %) and had nuclear DNA content of 1.88 and 3.75 pg, respectively, whereas the haploids were high variable (Cv = 29 %) with an average nuclear DNA amount of 0.89 pg. Our findings indicate that flow cytometry, together with production index, may be applied to reveal tetraploid regenerants and to remove haploids in rice breeding. That allows avoiding ex vitro trials of unpromising regenerants.

Keywords: Oryza sativa L., anther culture in vitro, flow cytometry, regenerant, haploid, dihaploid, tetraploid.