doi: 10.15389/agrobiology.2016.3.376rus
УДК 635.21:632.4:582.281.144:577.21
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 14-04-31613а и 16-04-00098) и Министерства образования и науки Российской Федерации (проект № RFMEFI62114X0003). Фитопатологическая оценка изолятов Phytophthora infestans выполнена в рамках Государственного задания 0598-2015-0018.
Авторы благодарят Центр коллективного пользования научным оборудованием ВНИИСБ «Биотехнология», в котором проводилось секвенирование Avr клонов и разделение SSR ампликонов капиллярным электрофорезом.
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА РАС-ДИФФЕРЕНЦИАТОРОВ Phytophthora infestans
Е.А. СОКОЛОВА1, Е.В. МОРОЗОВА2, Т.И. УЛАНОВА2,
О.П. МАЛЮЧЕНКО1, 3,
Я.И. АЛЕКСЕЕВ1, 3, М.А. КУЗНЕЦОВА2,
Э.Е. ХАВКИН1
Фитофтороз, возбудителем которого является оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, остается серьезной агрономической и экономической проблемой в картофелеводстве. Традиционная классификация специализированных рас Phytophthora infestans основана на 11 генах устойчивости (R-генах), перенесенных из Solanum demissum в культурный картофель S. tuberosum. Выборку сортов картофеля, каждый из которых несет один из этих R-генов, называют набором растений-дифференциаторов Мастенброка-Блека. Этот набор используют для определения генов вирулентности (r-генов) в изолятах и штаммах P. infestans. Коллекции таких индивидуальных штаммов поддерживают в качестве рас-дифференциаторов для выявления R-генов у культурных и дикорастущих растений Solanum. Хотя расы-дифференциаторы широко применяются в селекции картофеля на устойчивость к фитофторозу, они все еще недостаточно исследованы молекулярными методами. В настоящей работе мы изучали полиморфизм рас-дифференциаторов Phytophthora infestans, поддерживаемых в коллекции Всероссийского НИИ фитопатологии (Московская обл.). Для этого расы исследовали методом микросателлитного анализа по 12 геномным локусам; кроме того, провели сравнительный структурный анализ трех Avr генов, клонированных после ПЦР-амплификации геномной ДНК P. infestans. Геномную ДНК выделяли из 11 простых и сложных рас (1; 3; 4; 10; 11; 1.2; 1.3; 1.4; 1.2.3; 1.2.4; 1.2.3.4) и изолята 161, который содержал все 11 генов вирулентности. Нуклеотидные последовательности трех Avr генов депонировали в GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США) и сопоставили с другими хранящимися в нем последовательностями. Генотипирование рас-дифференциаторов P. infestans показало, что они резко отличаются от референтных A1 штаммов и высокоагрессивных линий, доминировавших в последние годы в Западной и Центральной Европе. SSR кластеры рас-дифференциаторов не согласовались с профилями r-генов. Гены ipiO (распознаются геном устойчивости RB/Rpi-blb1 растений S. bulbocastanum и его ортологом Rpi-sto1 S. stoloniferum),а также Avr3a и Avr4 (соответствуют генам R3a и R4 S. demissum) были обнаружены во всех исследованных изолятах P. infestans. Каждый ген был представлен несколькими аллелями. Сложный состав Avr генов противоречит традиционным представлениям о «простых» моногенных расах. В случае ipiO (номера последовательностей в GenBank KP308170-KP308174, KF154431-KF154433 и KF154434-KF154439) раса 1 была представлена аллелями I и II классов, в то время как расы 3 и 4 содержали только гены I класса. Ни в одной из этих рас не был обнаружен ген ipiO наиболее вирулентного III класса. Вирулентный аллель Avr3a_EM был найден у всех исследованных рас, а авирулентный аллель Avr3а_KI — только у рас 1, 3 и 1.2.3 (номера последовательностей KF154421-KF154426, KF154430, KP317568, KP317572, KP317580-KP317584, KP317588, KP317589). Ген Avr4 клонировали из рас-дифференциаторов 1, 3, 1.4 и 11 (KF188215-KF188223). Все эти расы содержали вирулентный аллель, а раса 11 несла вирулентный и авирулентный аллели. Результаты молекулярного и фитопатологического анализа Avr и r генов сходились лишь у 30 % рас. Причинами этих расхождений могли стать накопление мутаций в Avr генах рас-дифференциаторов в процессе их длительного поддержания в коллекции и более сложный состав R генов у растений-дифференциаторов, на которых эти расы изначально отбирались.
Ключевые слова: Phytophthora infestans, Avr гены, микросателлитные (SSR) маркеры.
MOLECULAR ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN DIFFERENTIATING Phytophthora infestans RACES
E.A. Sokolova1, E.V. Morozova2, T.I. Ulanova2, O.P. Malychenko1, 3,
Ya.I. Alekseev1, 3, M.A. Kuznetsova2, E.E. Khavkin1
Potato late blight caused by oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary is economically significant disease of worldwide importance. The traditional classification of specialized races of P. infestans is based on eleven resistance genes (R genes) introgressed from Solanum demissum to cultivated potato S. tuberosum. The selection of potato varieties, each comprising one of these R genes, is referred to as the Mastenbroek-Black set of differential plants. This set has been employed to establish the virulence genes (r genes) in isolates and strains of P. infestans, and collections of such individual strains have been maintained as tool sets of differential races for discerning R genes in cultivated and wild Solanum plants. While widely used in potato breeding for late blight resistance, these differential races have not been sufficiently explored by present-day molecular methods. We studied 11 differential races (1; 3; 4; 10; 11; 1.2; 1.3; 1.4; 1.2.3; 1.2.4; 1.2.3.4) maintained in the Institute of Phytopathology for over forty years and isolate 161 possessing all 11 genes of virulence. When the differential races of P. infestans were genotyped with the standard set of 12 microsatellite (simple sequence repeat, SSR) loci, these races were distinct from reference A1 strains and highly aggressive lines lately dominant in the Western and Central Europe. SSR clusters of differential races did not match their r gene profiles. To assess the profiles of virulence genes in the differential races of P. infestans, we cloned three avirulence genes (Avr genes): ipiO = Avr-blb1, which recognizes the Rpi-blb1 = Rpi-sto1 gene of S. bulbocastanum and S. stoloniferum characterized by broad resistance to P. infestans races, and also Avr3a and Avr4 corresponding to R3a and R4 of S. demissum. These Avr genes were found in all differential races under study, and each gene was represented by several alleles. The complex patterns of Avr genes are in sharp contrast with the conventional concept of «simple» monogenic races. In the case of ipiO (NCBI GenBank accession numbers KP308170-KP308174, KF154431-KF154433 and KF154434-KF154439) race 1 was represented by the alleles of classes I and II, whereas races 3 and 4 comprised only the class I genes. None of three races contained the most virulent class III ipiO gene. The virulent allele Avr3a_EM was found in all investigated races, while the avirulent allele Avr3a_KI was discerned only in races 1, 3 and 1.2.3 (KF154421-KF154426, KF154430, KP317568, KP317572, KP317580-KP317584, KP317588, KP317589). The Avr4 gene was cloned from differential races 1, 3, 1.4 and 11 (KF188215-KF188223). All these races contained the virulent allele, and race 11 comprised both avirulent and virulent alleles. The molecular and phytopathological evidence for Avr and r genes, respectively, matched only in 30 % of races. Probably, these discrepancies are due to the accumulation of mutations in the Avr genes of differential races in the course of their long-term maintenance in the collection and more complex composition of R genes in plants which were initially to select the differentiating races.
Keywords: Phytophthora infestans, Avr genes, microsatellite (SSR) markers.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ |
Поступила |
Оформление электронного оттиска
