doi: 10.15389/agrobiology.2016.3.385rus
УДК 634.2:632.3:578.1:57.083
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект № 14-24-00007.
УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ПРЕПАРАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ОСПЫ СЛИВЫ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ
А.А. ШЕВЕЛЕВА, Н.А. НИКИТИН, Е.А. ТРИФОНОВА,
А.В. ЗАКУБАНСКИЙ,
С.Н. ЧИРКОВ
В препаратах потивирусов белок оболочки (БО) обычно гетерогенен по молекулярной массе из-за частичного протеолиза N-концевого домена, происходящего, как считается, в процессе препаративного выделения и хранения вирусного препарата под действием клеточных протеаз, которые высвобождаются при гомогенизации растительных тканей и контаминируют очищенный препарат. Неупорядоченный N-домен БО вируса оспы сливы (Plum pox virus, PPV) длиной около 100 аминокислот экспонирован на поверхности вирусной частицы. Он содержит вирус- и штамм-специфичные эпитопы и является самой изменчивой частью молекулы БО. Деградация иммунодоминантного N-терминального домена затрудняет получение вирус-специфических антисывороток и штамм-специфических моноклональных антител и иммунохимический анализ вирусных изолятов. PPV считается самым вредоносным вирусным патогеном косточковых культур. Иммунохимические методы играют важнейшую роль в его диагностике, идентификации штамма, работе по получению устойчивых сортов, а также в эпидемиологических исследованиях и разработке превентивных мер по ограничению распространения этого вируса в насаждениях косточковых культур. Анализ БО PPV методами электрофореза в полиакриламидном геле, иммуноэлектронной микроскопии и вестерн-блота с моноклональными антителами 5В и 4DG5 соответственно к универсальному и PPV-D-специфичному эпитопам показал, что в очищенном вирусном препарате содержатся три типа субъединиц: полноразмерный БО и продукты частичного протеолиза БО с молекулярной массой 31 и 28 кДа. Три зоны БО PPV с аналогичной или близкой молекулярной массой регулярно выявлялись также при анализе экстрактов из свежих зараженных листьев табака Nicotiana benthamiana и ряда косточковых культур (персика, сливы и алычи), гомогенизированных непосредственно в буфере для нанесения образца, методом вестерн-блота с антителами к универсальному эпитопу. Эти результаты позволяют предположить, что протеолиз БО может происходить уже в зараженных клетках. Нами разработан усовершенствованный протокол препаративного выделения PPV, основанный на сочетании двух оригинальных методик (H.J. van Oosten, 1972; S. Lain с соавт., 1988). Процедура включает накопление вируса в растениях табака Nicotiana benthamiana, его экстракцию из зараженных листьев нейтральным HEPES-буфером, инкубацию экстракта, осветленного низкоскоростным центрифугированием, с 5 % Тритоном Х-100, ультрацентрифугирование на 20 % сахарозной подушке и очистку вируса посредством ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (10-40 %) в 0,1 М натрий-боратном буфере (рН 8,2). Метод обеспечивает выход очищенного вируса до 10 мг из 100 г свежих листьев. Вирусные частицы содержат преимущественно полноразмерный БО. Высокий выход обусловлен, по-видимому, эффективной экстракцией вируса с помощью HEPES-буфера, а также отсутствием потерь после осветления экстракта, его обработки Тритоном Х-100 и ультрацентрифугирования на сахарозной подушке. Применение Тритона Х-100 в указанной концентрации приводит к более полному отделению вируса от мембранных комплексов и солюбилизации агрегатов вирусных частиц, что повышает выход вируса. Использование таких вирусных препаратов для иммунизации животных может способствовать получению высокоспецифичных антисывороток и моноклональных антител для диагностики и иммунохимического анализа PPV.
Ключевые слова: вирус оспы сливы, препаративное выделение, белок оболочки, иммуноблот, иммуноэлектронная микроскопия, моноклональные антитела, эпитоп.
IMPROVED METHOD OF PURIFICATION OF Plum pox virus AND SEROLOGICAL ANALYSIS OF THE COAT PROTEIN
A.A. Sheveleva, N.A. Nikitin, E.A. Trifonova, A.V. Zakubanskiy,
S.N. Chirkov
Molecular weight heterogeneity of the coat protein (CP) is commonly observed in the purified potyvirus preparations due to partial proteolysis of the N-terminal domain exposed on the surface of viral particles. The cellular proteases released from disrupted plant tissues are believed to attribute to the partial CP proteolysis during purification and storage of the virus. The N-terminal domain is the most variable part of the CP. It displays virus- and strain-specific epitopes and is highly immunogenic. Degradation of the N-terminal domain creates a potential problem in the production of virus-specific antisera and strain-specific monoclonal antibodies and complicates the serological analysis of virus isolates. Plum pox virus (PPV) is considered the most important viral pathogen of stone fruit crops. Serological methods are of great importance for the diagnosis of PPV, strain identification, elaboration of PPV-resistant cultivars, epidemiological surveys and prevention of the uncontrolled spread of the virus in stone fruit plantings. The CP of PPV was studied by polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting and immunoelectron microscopy using monoclonal antibodies 5B and 4DG5 specific to the PPV universal and strain D epitopes, respectively. The purified virus particles have been shown to contain three types of subunits: full-size CP as well as the 28 and 31 kDa products of its partial proteolysis. Three bands of the similar molecular weight were also detected in the analysis of fresh extracts from PPV- infected Nicotiana benthamiana tobacco leaves and a number of stone fruits (peach, plum and cherry plum), homogenized directly in the sample buffer, by Western blotting with the antibody 5B suggesting that the CP can be proteolytically processed already in infected plant tissues. The improved procedure of PPV purification, based on the combination of two original methods (H.J. van Oosten, 1972; S. Lain et al., 1988) has been developed. The procedure included accumulation of the virus in N. benthamiana plants, its extraction from the infected leaves using a neutral HEPES buffer, the incubation of the clarified extract with 5 % Triton X-100, ultracentrifugation on a 20 % sucrose cushion and purification of the virus using the ultracentrifugation in sucrose concentration gradient (10-40 %) in a 0.1 М sodium borate buffer, рН 8.2. The method provided the yield up to 10 mg of the purified virus from 100 g of infected leaves. The virus particles contained mainly the full-size CP. The high yield of the virus seems to be due to an effective extraction of the virus using HEPES buffer as well as its negligible losses during clarification of the extract, treatment with Triton X-100 and ultracentrifugation on a sucrose cushion. The use of Triton X-100 in the specified concentration leads to a more complete separation of the virus from membrane complexes and solubilization of aggregates of viral particles, that increases the yield of the virus. Application of such the virus preparations for animal immunization can facilitate the high specific antisera and monoclonal antibodies production for reliable detection and serological analysis of PPV.
Keywords: plum pox virus, purification, coat protein, Western blot, immunoelectron microscopy, monoclonal antibody, epitope.
ФГБОУ ВО Московский государственный |
Поступила |
Оформление электронного оттиска
