doi: 10.15389/agrobiology.2016.3.392rus

УДК 632.938.2:577.112.4:577.112.6

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 15-29-05902.

 

ПОИСК АКТИВНОГО ЦЕНТРА ПЕПТИДИЛ-ПРОЛИЛ-цис/транс-ИЗОМЕРАЗЫ ИЗ Pseudomonas fluorescens, ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА ИНДУКЦИЮ УСТОЙЧИВОСТИ К ВИРУСУ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ У РАСТЕНИЙ ТАБАКА (Nicotiana tabacum L.)

В.Г. ДЖАВАХИЯ, Т.М. ВОИНОВА, Д.В. ШУМИЛИНА

Индуцирование устойчивости биогенными элиситорами или их аналогами признается перспективным направлением в современных технологиях защиты растений от болезней. Различные элиситоры, выделенные к настоящему времени из фитопатогенов или из не патогенных для растений микроорганизмов, представлены олигосахаридами, гликопротеинами, липидами, пептидами и белками. Первым белковым элиситором, нашедшим применение в сельском хозяйстве, был харпин, выделенный из бактерии Erwinia amylovora, на основе которого был разработан коммерческий препарат Messenger® (США). В проведенных нами ранее исследованиях из клеток штамма 197 Pseudomonas fluorescens был выделен белок-элиситор MF3, способный индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам. Столь широкий спектр действия предполагал перспективность использования MF3 в качестве потенциального средства защиты сельскохозяйственных культур от болезней. Была определена полная аминокислотная последовательность выявленного белка и показана высокая степень ее гомологии пептидил-пролил-цис/транс-изомеразам FKBP-типа той же бактерии, вследствие чего MF3 получил название Pf197_ППИ-аза. В отличие от многих белковых индукторов устойчивости растений к фитопатогенам Pf197_ППИ-аза обладает высокой термостабильностью, что облегчает выделение и очистку белка из клеточных лизатов с помощью их кипячения. Активные центры большинства известных белковых индукторов устойчивости растений к патогенам, как правило, связаны с наиболее консервативными участками полипептидной цепи. Мы предположили, что активный центр Pf197_ППИ-азы, ответственный за ее способность индуцировать устойчивость, может быть локализован в одной из наиболее консервативных аминокислотных последовательностей этого белка. Расчет такой последовательности при помощи биоинформационного ресурса PROSITE показал, что она содержит гидролизуемые трипсином сайты, образованные аминокислотами аргинином и лизином. Препараты Pf197_ППИ-азы были получены из штамма Escherichia coli BL21(DE3)+plMF3 — суперпродуцента ППИ-азы. Трипсинолиз Pf197_ППИ-азы приводил к утрате способности белка индуцировать устойчивость растений к патогенам, что косвенно подтвердило правильность нашего предположения об ответственности консервативного участка за элиситорную активность белка. Посредством химического синтеза (Пущинский филиал Института биоорганической химии) был получен соответствующий консервативному участку олигомер, состоящий из 29 аминокислот (Pf_29ак). Дальнейшие эксперименты показали, что эквимолярные концентрации Pf197_ППИ-азы и олигопептида Pf_29ак в одинаковой степени индуцируют устойчивость растений табака Nicotiana tabacum L. к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Это было подтверждено в биотесте при подсчете развившихся некрозов на листьях растений табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Xanthi (NN). Листья обрабатывали исследуемыми препаратами и помещали во влажную камеру, инкубировали 1 сут при 22 °С, после чего инокулировали вирусом и выдерживали во влажной камере 3-4 сут при 22 °С. Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что для индуцирования устойчивости растений к ВТМ достаточно одного консервативного участка Pf197_ППИ-азы. Далее предполагается определить минимальный размер активного центра, способного проявлять элиситорные свойства.   

Ключевые слова: индуцированная устойчивость растений к патогенам, белковые элиситоры, вирус табачной мозаики, пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы, консервативные последовательности белков.

   

Полный текст

 

SEARCH FOR THE ACTIVE CENTER OF PEPTIDYL-PROLYL cys/trans ISOMERASE FROM Pseudomonas fluorescens RESPONSIBLE FOR THE INDUCTION OF TOBACCO (Nicotiana tabacum L.) PLANT RESISTANCE TO TOBACCO MOSAIC VIRUS

V.G. Dzhavakhiya, T.M. Voinova, D.V. Shumilina

The induction of pathogen resistance with biogenic elicitors is now considered as a promising plant protection method. Elicitors obtained from fungal, bacterial, and oomycetic pathogens can be of peptide, glicoproteid, lipid, and oligosaccharide origin. The first reported protein elicitor was harpin isolated from Erwinia amylovora. Based on this elicitor, a Messenger® preparation intended to protect plants from a wide range of pathogens was developed and commercialized in USA. The MF3 protein able to induce the systemic resistance of plants to viral and fungal pathogens was isolated from the strain 197 of Pseudomonas fluorescens in the course of our earlier studies. Such a wide range of action assumed prospectivity of MF3 using as a potential plant protection remedy. The full amino acid sequence of this protein was determined, and its high homology to the FKBP-type peptidyl-prolyl cys/trans isomerases of the same bacteria was demonstrated, so the isolated protein was called Pf197_PPIase. As a rule, active centers of the majority of known elicitor proteins are localized at the most conserved domains. We supposed that the active center of Pf197_PPIase responsible for its ability to induce the resistance is localized within the most conserved sequence of this protein. The calculation of this sequence using a PROSITE bioinformational resource showed it contains sites composed of arginine and lysine and subjected to the tripsinolysis. The preparations  of  Pf197_PPIase were obtained from the recombinant strain of  Escherichia coli BL21(DE3)+plMF3 —  the super-producer of  Pf197_PPIase. The treatment of Pf197_PPIase with tripsin resulted in the loss of its elicitor properties that indirectly confirmed our hypothesis about the responsibility of the studied conserved domain for the elicitor activity of the MF3 protein. A Pf_29ac oligomer consisting of 29 amino acids and corresponding to the revealed conserved region was obtained by a chemical synthesis (Pushchino affiliated branch of the Institute of bioorganic chemistry). The further experiments showed that equimolar concentrations of Pf197_PPIase and Pf_29ac induced a similar level of resistance of tobacco plants to Tobacco Mosaic Virus (TMV). These results were confirmed  in biotests when necrosis were calculated on the surfaces of the inoculated tobacco leaves. The leaves were treated with preparations and incubated in wet chambers for 24 hours at 22 °C. After that the leaves were inoculated with viral suspension and incubated in wet chambers during 3-4 days at 22 °C. The obtained results permitted us to conclude the conserved domain of Pf197_PPIase alone is sufficient for the induction of the TMV resistance in tobacco. The further determination of a minimum size of the active center able to provide the elicitor activity is planned.

Keywords: induced disease resistance of plants, protein elicitors, tobacco mosaic virus, peptidyl-prolyl cis/trans isomerases, conserved protein domains.

 

ФГБНУ Всероссийский НИИ фитопатологии,
143050 Россия, Московская обл., Одинцовский р-н,
пос. Большие Вяземы, Институт, вл. 5,
e-mail: vitaly@vniif.ru, dzhavakhiya@yahoo.com, tatiana.voinova@bk.ru, dasha2409@yandex.ru

Поступила
в редакцию
19 ноября 2015 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало