Сельскохозяйственная биология, 2011, № 3, с. 123-126.

УДК 631.46:579.64:632.937.15:[632.7+632.4

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ Bacillus thuringiensis Berliner

О.В. СМИРНОВ, С.Д. ГРИШЕЧКИНА

У Bacillus thuringiensis (Bt), широко используемой в качестве основы биоинсектицидов, обнаружен антифунгальный и ростстимулирующие эффекты. Изучен спектр антифунгальной активности Bt против ряда фитопатогенных грибов и ее возможные механизмы. В вегетационных и полевых опытах проведена оценка антифунгальной активности в отношении Botrytis cinerea Pers., Fusarium oxysporum (Schlecht.), Snyd. et Hans. и Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker. Обсуждаются перспективы разработки биопрепаратов с полифункциональным действием.

Ключевые слова: антифунгальная активность, полифункциональное действие, Bacillus thuringiensis, грибы-фитопатогены.

У микробиологических средств биоконтроля вредителей сельскохозяйственных культур ассортимент и объемы применения значительно меньше, чем у экологически опасных химических пестицидов. При этом биопрепараты против фитопатогенов намного уступают микробным средствам, рекомендованным против насекомых-фитофагов. В настоящее время появляются данные об антифунгальном эффекте различных бактерий (1-3). Среди микробиологических средств защиты растений наиболее широко используются биопрепараты на основе энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis(Вt). Установлено антифунгальное действие энтомопатогенной Bас. thuringiensis Berliner (4, 5). Подобно другим бациллам Вt обладает множественностью физиологических и биохимических функций, обеспечивающих усвоение питательных субстратов, а также антибиоз в отношении партнеров по биоценозу, что позволяет разрабатывать полифункциональные биосредства одновременно против вредных насекомых и фитопатогенных грибов.
Мы изучали антифунгальное действие Bacillus thuringiensisв отношении возбудителей опасных болезней и ростстимулирующий эффект на растения.
Методика. В исследованиях использовали биопрепарат инсектицидного действия бацикол (на основе ВtН10) в виде сухого порошка (титр спор 50х10⁹/г) и жидкой формы (титр 3,5х10⁹/мл). Антифунгальную активность ВtН₁₀ определяли методом агаровых блоков в чашках Петри (6, 7). Препараты ВtН₁₀ (сухой порошок и жидкая форма) в различных концентрациях вносили в расплавленную и охлажденную до 40 °С среду Чапека. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Диаметр колоний гриба измеряли через 3 и 10 сут. Ингибирующую активность ВtН₁₀ рассчитывали по формуле Аббота (8):
Степень ингибирования роста колоний гриба =

х100,

где Дк и До — диаметр колонии гриба соответственно в контроле и опыте, см.
Для выявления фракции ВtН₁₀, ответственной за антифунгальный эффект, жидкую форму препарата разделяли центрифугированием на спорокристаллический комплекс и надосадочную жидкость. При оценке действия бацикола на Fusariumoxysporumи Bipolarissorokiniana в вегетационных условиях создавали искусственный инфекционный фон согласно методическим указаниям (9, 10). Против фузариозного увядания томатов почву, инфицированную F. oxysporum,проливали бациколом или его компонентами (100 мл на 1 кг почвы). Через 7 сут высаживали рассаду (сорт Грибовский) в фазе 1-го листа. Продолжительность опыта 7 нед. Для борьбы с гельминтоспориозной корневой гнилью семена ячменя сорта Луч, предварительно простерилизованные в растворе AgNO3, замачивали на 16 ч в жидком бациколе или его компонентах (надосадочная жидкость, спорокристаллический комплекс). Обработанные семена высевали в инфицированную почву через 7 сут после инокуляции Вipolaris sorokiniana. Длительность опыта 30 сут. При опрыскивании растений земляники сорта Царскосельская против серой гнили учитывали пораженность растений на 20-е и 30-е сут.
Распространение (Р) и развитие (R) болезни оценивали по общеизвестным формулам (11): Р = А x 100/N, где Р — доля больных растений, %; А — число больных растений; N — общее число растений в пробах; R = S (а x в)/N x K, где R — степень развития болезни; S (а x в) — сумма произведений числа пораженных растений (а) на соответствующий балл (в); N — общее число учтенных растений; К — высший балл поражения по шкале.
Результаты. При изучении действия ВtН10 на землянично-малинного долгоносика Anthonomus rubi Hbst. в полевых опытах установили заметное снижение не только численности целевого объекта (насекомого-вредителя), но и распространения серой гнили, вызываемой Botrytiscinerea (рис. 1). Наряду с энтомоцидным и антифунальным отмечали стимулирующий эффект препарата в отношении растений (увеличение числа соцветий на 10 %). Это побудило к оценке антифунгальной активности различных подвидов Bас.thuringiensis на более широком круге фитопатогенных грибов.

Рис. 1. Комплексное защитное действие Bacillus turingiensis H10 на землянике сорта Царскосельская в полевом опыте: А и Б — поражение соответственно землянично-малинным долгоносиком и серой гнилью, %; а, б — соответственно опыт и контроль (опытное поле Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии, 2001 год).

Ранее мы провели сра-внительное изучение эффекта различных подвидов Bас.thuringiensis на Botrytis cinerea в качестве модельного объекта (5) с использованием энтомоцидных биопрепаратов бацикол (Н₁₀), битоксибациллин (Н₁) и ларвицидного средства бактокулицид (Н₁₄) (табл. 1).
Даже при минимальном содержании (0,1 %) бацикол (сухой порошок) проявлял антифунгальный эффект. Увеличение концентрации препарата (до 2 % и более) вызывало полное подавление роста гриба уже через 3 сут. У других препаратов Bас. thuringiensis антифунгальное действие на Botrytiscinereaпроявлялось слабее.

Для выявления фракции биопрепаратов Bас. thuringiensis,ответственной за антифунгальный эффект, были испытаны различные компоненты жидкой формы биопрепарата на основе ВtН₁₀. Надосадочная жидкость оказалась малоэффективной даже в концентрации 4 %, а спорокристаллический комплекс проя-вил антифунгальную активность уже в концентрации 0,1 %.
В лабораторных экспериментах было обнаружено антифунгальное действие биопрепарата на основе ВtН₁₀ на ряд фитопатогенных грибов (табл. 2), однако эффективность отмечали не во всех случаях (она не проявилась против Scl. sclerotiorum, F. culmorum, F. graminearum).

В полевых опытах по оценке эффекта компонентов жидкой формы биопрепарата максимальную антифунгальную активность отмечали в варианте со спорокристаллическим комплексом Bас. thuringiensis. Увеличение нормы расхода приводило к соответствующему усилению антифунгального действия независимо от кратности обработки. В вегетационных опытах на томатах (сорт Грибовский) установили антифунгальный эффект ВtН₁₀ в отношении F. oхysporum. На искусственном инфекционном фоне к концу опыта распространение патогена в почве достигло 100 % при показателе развития болезни 41,6 %. Наибольшую антифунгальную активность регистрировали в варианте с проливом почвы спорокристаллическим комплексом Bас.thuringiensis (поражение растений — 10 %, развитие болезни — 5 %). Аналогичная тенденция прослеживалась при проливе инфицированной почвы жидким препаратом (соответственно 30 и 10 %). Важный аспект в этих наблюдениях также составляло обнаруженное ростстимулирующее действие биопрепарата ВtН₁₀: на неинфицированной почве без обработки этим средством по сравнению с вариантом, где почву обработали ВtН₁₀, растения отставали в росте на 13 %.
В опытах с предпосевной обработкой семян ячменя компонентами биопрепарата ВtН₁₀ антифунгальный эффект отмечали при обработке семян спорокристаллическим комплексом ВtН₁₀, а также нефракционированной жидкой формой биопрепарата. В первом варианте распространение болезни составило 26,0 % при степени развития болезни 8,5 % (соответствующие показатели в контроле без обработки семян — 64,0 и 29,5 %), нефракционированный биопрепарат снизил распространение болезни до 30,0 %, развитие — до 10,0 %.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о наличии у энтомопатогенной бактерии Bас. thuringiensis выраженных антифунгальных свойств. Наиболее сильно они проявились у представителя 10-го серотипа — продуцента биопрепарата бацикол, эффективного в отношении опасных массовых вредителей. В частности, помимо действия на землянично-малинного долгоносика, установлена энтомоцидная активность ВtН₁₀ в отношении ряда вредителей-фитофагов из отряда жесткокрылых (Coleoptera) — восточного горчичного листоеда (Colaphellus hofti Men.), колорадского жука (Leptinotarsa desemlineata Say.), крестоцветных блошек, комплекса видов из рода Phyllotreta, хлебной полосатой блошки (P. vittula Redt.), злаковой пьявицы (Oulema melanopus L.), рапсового цветоеда (Meligethes aeneus F.), капустного листоеда (Phaedon coclileariae F.), ильмового листоеда (Xanthogaleruca luteola Midler.).
Спектр действия ВtН₁₀ в отношении фитопатогенных грибов также охватывает представителей различных групп возбудителей опасных заболеваний многих культурных растений (см. табл. 2). Мы показали, что антифунгальная активность ВtН₁₀ в отношении разных видов грибов неодинакова. Кроме того, степень антифунгального эффекта у ВtН₁, ВtН₁₀ и ВtН₁₄(5) применительно к одному модельному виду (Botrytiscinerea) также варьировала. Это служит иллюстрацией селективности биофунгицидного действия представителей Bас.thuringiensis, которая представляет собой фундаментальное преимущество биоагентов по сравнению с химическими пестицидами.
Один из возможных механизмов антифунгального действия Bас.thuringiensis (а также других бацилл) связывают с их ферментативной активностью. Нами была установлена протеазная и хитиназная активность этой бациллы (12), что согласуется с данными литературы о способности микроорганизмов, в том числе бацилл, утилизировать мицелий и клеточные стенки грибов за счет хитиназ и протеаз — внеклеточных литических ферментов (13-15). Полученные результаты также согласуются с сообщением В.К. Чеботаря с соавт. (1) о том, что в антифунгальную активность штамма Ч-13 Bac. subtilis вносят вклад экзоферменты. Важно отметить, что многочисленные штаммы Bac. subtilis, характеризующиеся проявлением антифунгальной активности, не образуют ни термостабильного экзотоксина, ни кристаллов эндотоксина, как это имеет место у Bас. thuringiensis. Следовательно, антифунгальная активность Bac. subtilisсвязана с экзоферментами спор, что наблюдается и у Bac. thuringiensis. А.М. Асатурова (2) интерпретирует антифунгальный эффект Bac. subtilis на F. oxysporum совместным действием антибиотических веществ и миколитических ферментов. Л.К. Каменек с соавт. (16) усматривают связь антифунгального действия Bас. thuringiensis с активностью некоторых d-эндотоксинов.

Рис. 2. Ростстимулирующий эффект Bacillusthuringiensis H10 на различных культурах (лабораторные опыты).

Несомненно, что специфика взаимоотношений в каждой конкретной паре гриб — Bас. thuringiensis будет своя в соответствии с особенностями жизненной стратегии грибов, что и определит технологические подходы для применения биопрепарата в каждом конкретном случае. Синергетический эффект различных антифунгальных факторов Bас. thuringiensis может иметь аналогию с синергизмом энтомопатогенных факторов той же бактерии в отношении насекомых.
В отношении еще одного заслуживающего внимания аспекта полифункциональной активности Bас. thuringiensis — способности стимулировать рост растений отметим, что в серии лабораторных опытов по замачиванию семян ряда сельскохозяйственных культур (капуста, кабачок, салат, томат, ячмень) и последующему проращиванию их в рулонах фильтровальной бумаги мы отмечали достоверное увеличение длины проростков по сравнению с контролем (варианты без обработки) (рис. 2). Полученные результаты хорошо согласуются с данными о комбинированном (антифунгальном и ростстимулирующем) действии биопрепарата аурина, разработанного на основе Pseudomonas aurantiaca(16).
Совокупность данных по антифунгальному эффекту ВtН₁₀ и некоторых других разновидностей Bас.thuringiensis представляет значительный теоретический и практический интерес. Изучение биохимии и генетики Bас.thuringiensis позволит выявить и идентифицировать ее метаболиты, ответственные за различные стороны полифункциональной активности этой бациллы.
Результаты изучения антифунгального действия Bас.thuringiensis позволили ранее обосновать новый патотип этой бациллы — F (fungi — грибы) (4). Тогда каждый конкретный штамм Bас.thuringiensis, отнесенный к определенному патотипу с учетом его энтомоцидного действия, будет также принадлежать (или не принадлежать) к патотипу F.
Актуальность создания препаратов с комплексным действием обусловлена узким ассортиментом биологических средств вообще и биопрепаратов против фитопатогенов в особенности. Перечень немногочисленных видов бактерий с фунгицидным действием включает Bac.subtilis (бактофит, алирин-Б, гамаир, бисолбисан, фитоспорин, баксис); Bac.nigrum (бактрил); Pseudomonas fluorescens (бинорам, планриз); Ps. aerofaciens (псевдобактерин-2). В соответствии с приведенными результатами исследований к нему также могут быть отнесены вид Bас.thuringiensis и энтомоцидный биопрепарат бацикол на основе ВtН₁₀, проявивший достоверный антифунгальный эффект в отношении ряда фитопатогенных грибов.
Итак, совокупность экспериментальных данных характеризует Bacillusthuringiensisкак перспективный продуцент полифункционального биопрепарата, сочетающего антифунгальный и энтомоцидный эффекты с ростстимулирующим действием на растения. При уточнении селекционных критериев для штаммов-продуцентов при отборе на антифунгальную активность (в качестве таковых может выступать эффективность хитиназ и других экзоферментов, продуцируемых тем или иным штаммом) задача разработки подобного препарата представляется вполне осуществимой.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Ч е б о т а р ь  В.К.,  З а в а л и н  А.А.,  К и п р у ш к и н а  Е.М. Эффективность применения препарата экстрасол. М., 2007.
2. А с а т у р о в а  А.М. Перспективные штаммы бактерий — продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике. Автореф. канд. дис. СПб—Пушкин, 2009.
3. Б о р о н и н  А.М.,  К о ч е т к о в  В.В. Биологические препараты на основе псевдомонад. Агро ХХI, 2000, 3: 3-5.
4. С м и р н о в  О.В. Патотипы Bacillusthuringiensis и экологические основы их использования в защите растений. Автореф. докт. дис. СПб—Пушкин, 2000.
5. Г р и ш е ч к и н а  С.Д.,  С м и р н о в  О.В.,  К а н д ы б и н  Н.В. Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillusthuringiensis. Микология и фитопатология, 2002, 36(1): 58-62.
6. Методы экспериментальной микологии /Под ред. В.И. Билай. Киев, 1982.
7. С о к о л о в а  М.В. Хитинолитическая и антигрибная активность трех штаммов бактерий рода Serratia. В сб. науч. тр. ВИЗР: Современная биотехнология в решениях проблем. СПб, 1995: 214-224.
8. Х о х р я к о в  М.К.,  П о т л а й ч у к  В.И.,  С е м е н о в  А.Я. Определитель болезней сельскохозяйственных культур. М., 1984.
9. С и д о р о в а  С.Ф.,  П о п о в  В.И. Методические указания по изучению вертициллезного и фузариозного увядания однолетних сельскохозяйственных растений. Л.—Пушкин, 1980.
10. К о т о в а  В.В. Методические указания по изучению вредоносности корневой гнили яровой пшеницы и ячменя и методы расчета потерь от болезней. Л., 1979.
11. В л а с о в  Ю.И.,  Г а в р и л о в а  Е.А.,  М и н к е в и ч  И.И.,  Ч у м а к о в  А.Е. Основные методы фитопатологических исследований. М., 1974.
12. С м и р н о в  О.В.,  Г р и ш е ч к и н а  С.Д. Изучение действия биопрепаратов на основе Bacillusthuringiensisна фитопатогенные грибы. Вест. защиты растений, 2010, 1: 27-35.
13. Т р а ч у к  Л.А.,  Ш е м я к и н а  Т.Г.,  Ч е с т у х и н а  Г.Г. и др. Хитиназы Bacilluscereus: выделение и характеристика. Биохимия, 1996, 61(2): 357-368.
14. R e y e s - R a m i r e z  B.I.,  E s c u d e r o - A b a r c a  G.,  A g u i l a r - U s c a n g a  P.M. e.a. Antifungal activity of Bacillus thuringiensis chitinase and its potential for the biocontrol of phytopathogenic fungi in soybean seeds. J. Food Sci., 2006, 69(5): М131-М134.
15. Т а т а р и н о в а  Н.Ю.,  Г р и н ч е н к о  О.С.,  В а р л а м о в  В.П. и др. Хитинолитический комплекс ферментов Streptomiceskurssanovii и его использование против возбудителя фузариоза пшеницы Fusariumculmorum. Прикладная биохимия и микробиология, 1996, 32(2): 242-246.
16. К а м е н е к  Л.К.,  К а м е н е к  В.М.,  К а м е н е к  Д.В. Перспектива применения препаратов на основе дельта-эндотоксина Bacillusthuringiensis в сельском хозяйстве. Мат. VII Межд. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск, 2010: 447-448.

POLYFUNCTIONAL ACTIVITY OF Bacillus thuringiensis Berliner

O.V. Smirnov, S.D. Grishechkina

The results of polyfunctional activity studies of the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis which are widely used as the basis for bioinsecticides development are presented. The antifungal and phytostimulatory activity of Bас. thuringiensis Berliner is demonstrated. The spectrum of antifungal activity of Bас. thuringiensis includes Botrytis cinerea, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum etc. The tendencies of creating ecologically safe biopreparations with complex activity based on Bас. thuringiensis are viewed.

Keywords: antifungal activity, polyfunctional activity, Bacillus thuringiensis, phytophathogenic fungi.

Оформление электронного оттиска