УДК 631.46:579.64:575:577.2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ МИКРОСИМБИОНТОВ КОПЕЕЧНИКА (Hedysarum) И АСТРАГАЛА (Astragalus) НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОВ РИБОСОМАЛЬНЫХ РНК

В.И. САФРОНОВА, Е.П. ЧИЖЕВСКАЯ, А.А. БЕЛИМОВ, Е.А. ПАВЛОВА

У 22 штаммов ризобий (Всероссийская коллекция непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии - ВНИИСХМ) из корневых клубеньков у Astragalus sp., А. frigidus, A. uliginosus, A. falcatus, A. cicer и Hedysarum alpinum определяли видовую принадлежность методом секвенирования гена 16S-рРНК (rrs) и последовательности между 16S- и 23S-рДНК (ITS регион) и определяли их симбиотические свойства. Три штамма, изолированных из астрагала, отнесены к виду Mesorhizobium loti, один идентифицирован как Rhizobium leguminosarum. Два микросимбионта A. cicer с высокой долей вероятности относятся к новому виду рода Mesorhizobium. Разделение клубеньковых бактерий на филогенетические кластеры не коррелировало с географическим происхождением штаммов и видом растения, из которого их выделили. Изоляты образуют группу перекрестной инокуляции и отличаются широким спектром хозяйской специфичности, включающим бобовые растения различных триб галегоидного комплекса (Galegeae, Hedysareae, Trifolieae, Loteae и Coronilleae).

Ключевые слова: клубеньковые бактерии, микросимбионты астрагала и копеечника, таксономия, секвенирование генов рибосомальных РНК.

Клубеньковые азотфиксирующие бактерии семейства Rhizobiaceae относятся к наиболее обширной и важной таксономической группе почвенных микроорганизмов. У многих видов бобовых клубеньковые бактерии не изучены или их исследование находится на начальном этапе. Так, мало изучены микросимбионты засухоустойчивых кормовых культур Astragalus и Hedysarum, обладающих высокой питательной ценностью и перспективных для возделывания в условиях дефицита влаги (1-3). Немногочисленные данные литературы, описывающие микросимбионтов астрагала, дают представление о большом разнообразии этих микроорганизмов, которые могут принадлежать к разным родам семейства RhizobiaceaeRhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium и Mesorhizobium (4-6).

Среди микросимбионтов копеечника описаны ризобиальные и мезоризобиальные штаммы (7, 8). В настоящее время видовая принадлежность определена только для клубеньковых бактерий у Hedysarum coronarium — R. sullae (9), а также у астрагалов китайского происхождения: A. scobwerrimus, A. complanatus, A. chrysopterus R. loessense(10), A. adsurgensM. septentrionale иM. temperatum (11), A. sinicusM. huakuii (12).
Цель работы состояла в определении таксономического положения ризобиальных штаммов различного географического происхождения, выделенных у астрагала и копеечника.
Методика. Объектом исследования были 22 штамма, изолированные с помощью традиционной методики (13) из корневых клубеньков нескольких видов астрагала (Astragalus sp., А. frigidus, A. uliginosus, A. falcatus, A. cicer) и копеечника (Hedysarum alpinum). Симбиотические свойства изолятов изучали в условиях стерильного микровегетационного опыта в пробирках с вермикулитом и средой Красильникова-Кореняко. Азотфиксирующую активность штаммов измеряли по редукции ацетилена на газовом хроматографе (13).При первичном определении видовой принадлежности штаммов использовали метод секвенирования гена 16S-рРНК (rrs), при уточнении таксономического положения бактерий — секвенирование более вариабельной области между 16S- и 23S-рДНК (ITS регион). Для амплификации 16S-рДНК (около 1500 п.н.) применяли праймеры fD1 (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) и rD1 (5´-AAGGAGGTGATCCAGCC-3´), для ITS региона (800 п.н.) - FGPS 1490-72 и FGPL-132 (соответственно 5´-TGCGGCTGGATC-CCCTCCTT-3´ и 5´-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3´). Полученный ПЦР-продукт очищали и клонировали в плазмиде pTZ57R/T с использованием PCR Product Cloning Kit («Fermentas», США) для последующего секвенирования. Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью базы данных GenBank (программа BLAST). Для конструирования филогенетического дерева применяли программу MEGA3 9 (метод Neighbor-Joining). Пары последовательностей сравнивали по числу различающихся нуклеотидов.
Результаты. Данные о происхождении исследованных нами штаммов приведены в таблице 1. Как известно, метод секвенирования ITS региона более чувствителен и обладает большей разрешающей способностью при идентификации близкородственных штаммов, чем секвенирование гена 16S-рРНК (14). Анализ ITS последовательностей ризобиальных штаммов показал, что исследуемые изоляты формируют 7 достоверно различающихся групп (рис.).

Кластеры I, VI и VII включали соответственно типовые штаммы Mesorhizobiumhua-

1. Штаммы клубеньковых бактерий, исследованные в работе

Штамм

Растение-хозяин

Происхождение

CIAM 1403
CIAM 1404
CIAM 1405
CIAM 1406
CIAM 1409
CIAM 1410
CIAM 1414
CIAM 1415
CIAM 1418
CIAM 0201
CIAM 0202
CIAM 0203
CIAM 0204
CIAM 0205
CIAM 0206
CIAM 0207
CIAM 0208
CIAM 0209
CIAM 0211
CIAM 0212
CIAM 0217
CIAM 0218

Hedysarum alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
Astragalus sp.
A. frigidus
A. cicer
A. cicer
A. uliginosus
A. uliginosus
A. falcatus
A. cicer
A. cicer
A. uliginosus
A. falcatus
A. falcatus
A. uliginosus

Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
г. Москва
г. Москва
г. Новосибирск
г. Новосибирск
г. Минск (Белоруссия)
г. Минск (Белоруссия)
г. Воркута
г. Воркута
г. Ставрополь
г. Полтава (Украина)
г. Полтава (Украина)
Алтай
Алтай
Алтай
Алтай

kuii, M. loti и Rhizobium leguminosarum. Все штаммы, выделенные из копеечника, формировали одну ITS-группу (I кластер, см. рис.), гомологичную виду M. huakuii, описанному для микросимбионтов растения Astragalussinicus(12). Показано, что исследуемые изоляты копеечника дей-ствительно способны вступать в симбиоз с астрагалами (A. cicer) (табл. 2). Однако принадлежность микросимбионтов копеечника к виду M. huakuii представляется сомнительной, поскольку степень гомологии между представителями этих групп по гену rrs составила 96,0 %, что для этого высококонсервативного локуса считается низким значением. Известно, что представители рода Mesorhi-zobium образуют гомогенную группу при анализе последовательности 16S-рДНК. К примеру, гомология между типовыми штаммами M. plurifarium и M. amorphae равняется 99,5 % (15).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Симбиотические свойства исследуемых изолятов ризобий копеечника (Hedysarumalpinum)и астрагала (Astragalus) при инокуляции различных видов растений

Кластер, штамм

H. alpinum

A. cicer

Lotus
corniculatus

Glycyrrhiza
uralensis

Onobrychis
viciifolia

Ononis 
arvensis

Oxytropis 
campestris

И з о л я т ы  к о п е е ч н и к а

I ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 1406
CIAM 1410
CIAM 1414
CIAM 1415

Fix
Fix
Fix
Fix

Nod
Nod
Fix
Nod

0
0
0
0

Fix
Nod
Fix
Fix

0
0
Fix
0

Fix
Fix
Fix
Fix

Fix
Fix
Fix
Fix

И з о л я т ы   а с т р а г а л а

II ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 0201
CIAM 0202
CIAM 0218

Fix
Fix
Fix

Fix
Fix
Fix

0
0
0

Fix
Fix
Fix

0
0
0

Fix
Fix
Fix

Fix
0
Nod

III ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 0208
CIAM 0209

0
Nod

Fix
Fix

0
0

Fix
Fix

0
0

0
0

0
Fix

IV ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 0211
CIAM 0217

Fix
Fix

Fix
Fix

0
0

Nod
Nod

Fix
Fix

Fix
Fix

Fix
Fix

V ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 0203
CIAM 0204

Fix
Nod

Fix
Fix

0
0

Fix
Fix

0
0

0
0

Fix
Fix

VI ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 0205
CIAM 0206
CIAM 0212

Fix
Fix
Fix

Fix
Fix
Fix

0
0
0

Fix
Nod
Nod

Nod
Nod
Nod

Nod
Nod
Fix

Fix
0
Fix

VII ITS-кластер:

 

 

 

 

 

 

CIAM 0207

0

Fix

0

Nod

Nod

Nod

0

Mesorhizobium loti:

 

 

 

 

 

 

CIAM 1801
CIAM 1802
CIAM 1804

0
0
0

Fix
Fix
Fix

Fix
Fix
Fix

0
Nod
Nod

0
0
0

Fix
Fix
Fix

0
0
0

П р и м е ч а н и е. 0 — клубеньки отсутствуют, Nod — неактивные клубеньки, Fix — азотфиксирующие клубеньки.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

На основании результатов секвенирования гена rrs,а также анализа последовательности ITS региона штаммы-микросимбионты астрагала CIAM 0205, CIAM 0206 и CIAM 0212 (VI ITS-кластер) были идентифицированы как M. loti (степень гомологии с типовым штаммом ATCC33669 — 99,1 и 96,7 % соответственно по 16S-рДНК и ITS региону). Следует отметить, что представители вида M. loti нодулируют широкий спектр бобовых растений, которые относятся к различным трибам семейства Fabaceae. Например, штаммы M. loti CIAM 1801, CIAM 1802 и CIAM 1804 из коллекции ВНИИСХМ вступали в азотфиксирующий симбиоз с растениями астрагала (A.cicer) и остролодочника (Oxytropis campestris), а также образовывали неактивные клубеньки на солодке (Glycyrrhiza uralensis). Изоляты астрагала из VI кластера не нодулировали растения лядвенца (Lotus corniculatus) в стерильных микровегетационных опытах, однако вступали в азотфиксирующий симбиоз с копеечником (H. alpinum), а также образовывали клубеньки (в ряде случаев активные) на корнях солодки (Gly-cyrrhiza uralensis), эспарцета (Onobrychis viciifolia), стальника (Ononis arvensis) и остролодочника (Oxytropis campestris) (табл. 2). Наиболее близкими к указанным изолятам (с разницей 1-2 нуклеотида в последовательности ITS) были три штамма, изолированные из растения Gueldenstaedtia himalaica, которое является родственником астрагала и также принадлежит к трибе Galegeae. Единственный из исследованных быстрорастущий штамм CIAM 0207 (VII ITS-кластер) был отнесен к виду R. leguminosarum (гомология с типовым штаммом LMG 14904 — 99,3 % по гену rrs и 96,0 % по ITS региону). Быстрорастущий штамм CIAM 0207 обладал более узким спектром хозяйской специфичности и не образовывал клубеньки ни на копеечнике, ни на остролодочнике.


ITS-филограмма, отражающая таксономическое положение исследуемых изолятов копеечника (Hedysarumalpinum)и астрагала (Astragalus): I-VII — статистически достоверные кластеры. В скобках указан вид растения-хозяина.

Степень гомологии между 16S-рДНК типового штамма A-1BS M. tianshanense и штаммов CIAM 0201, CIAM 0202, CIAM 0218 (II ITS-кластер), CIAM 0208, CIAM 0209 (III ITS-кластер) и CIAM 0211, CIAM 0217 (IV ITS-кластер) составляла 99,5-99,7 %. Однако последовательность ITS региона у этих трех групп изолятов существенно отличалась от таковой у референтных штаммов M. tianshanense(максимально 93,6 % гомологии). Этот факт затрудняет отнесение перечисленных выше микросимбионтов астрагала к виду M. tianshanense, поскольку считается, что штаммы клубеньковых бактерий одного вида не могут иметь меньше 95 % гомологии по ITS (16, 17). Эти результаты позволяют сделать вывод об отсутствии в базе данных GenBank штаммов, близкородственных CIAM 0203 и CIAM 0204 (V ITS-кластер), изолированным из клубеньков астрагала нутового (A. cicer): наибольшая степень гомологии с типовыми штаммами M. loti и M. ciceri составляла 98,9 % по гену rrs и 91,2 % по ITS региону.
Спектры хозяйской специфичности изолятов астрагала II-VII ITS-кластеров оказались уникальны для каждой группы (см. табл. 2). Однако однозначной корреляции между хозяйской специфичностью и филогенией штаммов выявлено не было. В целом можно отметить, что эти изоляты образуют группу перекрестной инокуляции и характеризуются широким спектром хозяйской специфичности, включающим бобовые растения различных триб галегоидного комплекса (Galegeae, Hedysareae, Trifolieae, Loteae и Coronilleae).
Таким образом, три микросимбионта астрагала отнесены к виду Mesorhizobium loti, один — к Rhizobium leguminosarum. Два штамма из Astragaluscicer (V ITS-кластер) с высокой долей вероятности относятся к новому виду рода Mesorhizobium. Таксономическое положение мезоризобиальных изолятов астрагала и копеечника, сформировавших I-IV кластеры, неясно, поскольку результаты секвенирования ITS региона и гена rrsне подтверждают друг друга. Распределение клубеньковых бактерий астрагала на кластеры не коррелировало с географическим происхождением штаммов и видом растения, из которого их выделили.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. А н д р е е в  Н.Г. Луговое и полевое кормопроизводство. М., 1989.
2. Ю н у с б а е в  У.Б. Оптимизация нагрузки на естественные пастбища: Метод. пос. Саратов, 2001.
3. S t r u f f i  P.,  C o r i c h  V. Metabolic properties, stress tolerance and macromolecular profiles of rhizobia nodulating Hedysarum coronarium. J. Appl. Microbiol., 1998, 84(1): 81-89.
4. G a o  J.,  T e r e f e w o r k  Z.,  C h e n  W. e.a. Genetic diversity of rhizobia isolated from Astragalus adsurgens growing in different geographical regions of China. J. Biotechnol., 2001, 91: 155-168.
5. L a g u e r r e  G.,  V a n  B e r k u m  P.,  A m a r g e r  N. e.a. Genetic diversity of rhizobial symbionts isolated from legume species within the genera Astragalus, Oxytropis, and Onobrychis. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63(12): 4748-4758.
6. W d o w i a k  S.,  M a l e k  W. Numerical analysis of Astragalus cicer microsymbionts. Curr. Microbiol.,2000, 41: 142-148.
7. K i s h i n e v s k y  B.D.,  N a n d a s e n a  K.G.,  Y a t e s  R.J. e.a. Phenotypic and genetic diversity among rhizobia isolated from three Hedysarum species: H. spinosissimum, H. coronarium and H. flexuosum. Plant and Soil, 2002, 251: 143-153.
8. S a f r o n o v a  V.I.,  P i l u z z a  G.,  B e l i m o v  A.A. e.a. Phenotypic and genotypic analysis of rhizobia isolated from pasture legumes native of Sardinia and Asinara Island. Antonie Van Leeuwenhoek, 2004, 85: 115-127.
9. S q u a r t i n i  A.,  S t r u f f i  P.,  D o r i n g  H. e.a. Rhizobium sullae sp. nov. (formerly Rhizobium hedysari), the root-nodule microsymbiont of Hedysarum coronarium L. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52: 1267-1276.
10. W e i  G.H.,  T a n  Z.Y.,  Z h u  M.E. e.a. Characterization of rhizobia isolated from legume species within the genera Astragalus and Lespedeza grown in the Loess Plateau of China and description of Rhizobium loessense sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1575-1583.
11. G a o  J.L.,  T u r n e r  S.L.,  K a n  F.L. e.a. Mesorhizobium septentrionale sp. nov. and Mesorhizobium temperatum sp. nov., isolated from Astragalus adsurgens growing in the northernregions of China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2003-2012.
12. C h e n  W.X.,  L i  G.S.,  Q i  Y.L. e.a. Rhizobium huakuii sp. nov. isolated from the root nodules of Astragalus sinicus. Int. J. Syst. Вacteriol., 1991, 41: 275-280.
13. N o v i k o v a  N.,  S a f r o n o v a  V. Transconjugants of Agrobacterium radiobacter harbouring sym genes of Rhizobium galegae can form an effective symbiosis with Medicago sativa. FEMS Microbiol. Lett., 1992, 93: 261-268.
14. V i n u e s a  P.,  L e o n - B a r r i o s  M.,  S i l v a  C. e.a. Bradyrhizobium canariense sp. nov., an acid-tolerant endosymbiont that nodulates endemic genistoid legumes (Papilionoideae: Genisteae) from the Canary Islands, along with Bradyrhizobium japonicum bv. genistearum, Bradyrhizobium genospecies alpha and Bradyrhizobium genospecies beta. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55: 569-575.
15. W a n g  E.T.,  V a n  B e r k u m  P.,  S u i  X.H. e.a. Diversity of rhizobia associated with Amorpha fruticosa isolated from Chinese soils and description of Mesorhizobium amorphae sp. nov. Int. J. Syst. Вacteriol., 1999, 49: 51-65.
16. R i v a s  R.,  W i l l e m s  A.,  P a l o m o  J.L. e.a. Bradyrhizobium betae sp. nov., isolated from roots of Beta vulgaris affected by tumour-like deformations. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 1271-1275.
17. W i l l e m s  A.,  M u n i v e  A.,  D e  L a j u d i e  P. e.a. In most Bradyrhizobium groups sequence comparison of 16S-23S rDNA internal transcribed spacer regions corroborates DNA-DNA hybridizations. Syst. Appl. Microbiol., 2003, 26: 203-210.

TAXONOMY OF MICROSYMBIONTS OF Hedysarum AND Astragalus BASING ON RIBOSOMAL RNA GENES SEQUENCING

V.I. Safronova, E.P. Chizhevskaya, A.A. Belimov, E.A. Pavlova

The study of taxonomic positionn and symbiotic properties of 22 rhizobial strains from All-Russian collection of nonpathogenic microorganisms for agricultural purposes, which were isolated from root nodules of Astragalus sp., A. frigidus, A. uliginosus, A. falcatus, A. cicer and Hedysarum alpinum, was conducted. For identification the method of 16S rRNA gene (rrs) and 16S-23S rDNA (ITS region) sequencing was used. Three strains from Astragalus belonged to Mesorhizobium loti, one isolate was identified as Rhizobium leguminosarum. Two isolates from A. cicer most probably belong to new species within Mesorhizobium. Taxonomic position of Hedysarum microsymbionts and other isolates from Astragalus remains not clear, as the results of ITS and rrs sequencing do not confirm each other. Division of rhizobial isolates into phylogenetic clusters correlated neither with geographical origin of strains nor with species of plant which they were isolated from. There was not also a significant correlation between plant host range and taxonomic relationship of strains. These isolates form the wide cross inoculation group, including the leguminous plants from different tribes within the Galegoid complex (Galegeae, Hedysareae, Trifolieae, Loteae and Coronilleae).

Keywords: root nodule bacteria, Astragalus and Hedysarum microsymbionts, taxonomy, rrs and ITS sequencing.

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,

196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: v.safronova@rambler.ru

Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало