БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ

ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ

КАРТА САЙТА

НА ГЛАВНУЮ

Сельскохозяйственная биология, 2011, № 3, с. 116-118.

УДК 631.559.2:631.847.21:579.64

СОЗДАНИЕ СТАБИЛЬНОЙ ФОРМЫ РОСТСТИМУЛИРУЮЩИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Ю.В. ЛАКТИОНОВ, Т.А. ПОПОВА, О.А. АНДРЕЕВ, Р.П. ИБАТУЛЛИНА, А.П. КОЖЕМЯКОВ

Выполнено комплексное изучение свойств вермикулита как перспективного носителя для препаратов эндосимбиотических и ассоциативных бактерий. Оптимизированы сочетания стабилизирующих, питательных и защитных субстратов, обеспечивающих длительное хранение и высокую эффективность биопрепаратов. Изготовление препаратов на основе вермикулита технологичнее и экономичнее, полученные биопрепараты высокоэффективны. Усовершенствованный состав жидкой препаративной формы увеличил срок хранения.

Ключевые слова: биопрепарат, клубеньковые бактерии, урожайность, носитель, вермикулит.

 

В настоящее время усилился интерес к экологически безопасным и экономичным агротехнологиям, повышающим продуктивность за счет применения биопрепаратов на основе эндосимбиотических и ассоциативных микроорганизмов (1-5) с комплексом положительных эффектов на растения (5-7), которые хорошо приживаются в ризосфере или на корнях. Для каждого вида бобовых препараты (нитрагины) изготавливаются с использованием специфических штаммов клубеньковых бактерий (для сои — Bradyrhizobium japonicum, козлятника — Rhizobium galegae и т.д.). Препараты для других видов растений готовятся на основе ассоциативных бактерий (мизорин — Arthrobacter mysorens, азоризин — Azospirillum brasilense, ризоагрин — Agrobacterium radiobacter). Такие препараты существенно улучшают почвенное плодородие и совершенно безопасны для человека, животных и других компонентов биоценозов (4-8). В России долгое время наиболее распространенным твердым носителем для клубеньковых бактерий оставался торф, но его недостатки — ограниченность ресурсов, отвечающих технологическим требованиям, вариабельность биохимических характеристик, необходимость дорогостоящей g-стерилизации и множества предварительных операций (сушка, нейтрализация, размол и др.) (9). В связи с этим практикой был востребован поиск экологичного и технологичного носителя, способного обеспечивать длительную сохранность микроорганизмов в препарате.
Цель нашей работы — создание технологичных форм биопрепаратов высокого качества для основных сельскохозяйственных культур.

Методика.

Использовали клубеньковые бактерии козлятника (Rhizobiumgalegae) и сои (Bradyrhizobiumjaponicum), в качестве носителей — вспученный вермикулит или торф (влагоемкость вермикулита — 500 %). Примененные стабилизирующие и питательные добавки: дарина (комплексный препарат на основе сапропеля с добавками питательных макроэлементов и микроэлементов), меласса, калиевые гуматы (группа природных высокомолекулярных веществ с высокой физиологической активностью), глицерин (распространенный криопротектор) (10), глюкозу, сорбат калия (природный консервант, применяется при пищевом консервировании) карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, продукт взаимодействия целлюлозы с монохлоруксусной кислотой, используется как стабилизатор консистенции, загуститель, средство для капсулирования) (перед внесением добавки стерилизовали). Для определения жизнеспособности и титра бактерий использовали метод серийных предельных разведений (11-13). Быстрорастущие бактерии культивировали на бобовой среде следующего состава: горох, сахароза, КН2Р04, К2НР04, MgSО4?7H20, (NH4)2SO4, дрожжевой экстракт и СаСО3 — соответственно 70; 10; 0,5; 0,5; 0,2; 1; 1 и 1 г/л. Среда для медленнорастущих бактерий содержала те же компоненты, но меньше сахарозы (2,5 г/л) и дополнительно глюкозу (10 г/л). Полевые опыты проводили в условиях лесостепной зоны Алтайского Приобья. Почва участка — чернозем обыкновенный маломощный малогумусный среднесуглинистый. Характеризуется нейтральной реакцией почвенного раствора (рН 6,9), средней обеспеченностью подвижным P и высокой — обменным К. Повторность опыта — 4-кратная.
Для подтверждения достоверности различий между вариантами определяли наименьшую существенную разницу (НСР).

Результаты.

Вермикулит имеет постоянный химический состав, благодаря чему исключается необходимость проверки каждой партии носителя. При использовании технологии, разработанной для получения биопрепаратов на основе торфа, титры препаратов на основе вермикулита спустя 6 мес хранения составляли 5x10⁶-1,8x10⁸ КОЕ/г. Эти значения недопустимы, так как по ГОСТУ и ТУ биопрепараты на основе клубеньковых бактерий считаются качественными, если через 6 мес хранения имеют титр не менее 1x10⁹ КОЕ/г.
Оценка эффекта питательных и стабилизирующих добавок на повышение сохранности микроорганизмов (табл. 1) показала, что через 17 сут титры во всех вариантах были высокими и варьировали от 1,5x10⁹ до 34,1x10⁹ КОЕ/г. Минимальный титр получили при добавлении в вермикулит 1 % глюкозы и 2 % мелассы, но через 1 мес он возрос до 15,6x10⁹ КОЕ/г. В 2 раза увеличился титр бактерий при внесении в вермикулит 1 % глюкозы и 1 % гуматов. Спустя 6 мес наибольшим был титр в варианте с добавлением в вермикулит 0,5 % мелассы, 1 % глицерина и 0,5 % гуматов. По-видимому, это связано с разной динамикой использования указанных компонентов, что способствовало поддержанию достаточного питания клеток на протяжении всего срока хранения.

1. Динамика титра (x109 КОЕ/г) клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum (штамм 634б) в процессе хранения при внесении оптимизирующих добавок в вермикулит (X±x)
Добавка в вермикулит	0 сут	17 сут	1 мес	6 мес
Глюкоза 1 %	4,0±0,2	16,5±0,2	14,0±0,2	1,1±0,2
Глюкоза 1 % + дарина 1 %	4,0±0,2	27,6±0,3	40,0±0,2	3,2±0,1
Глюкоза 1 % + глицерин 1 %	4,0±0,2	27,1±0,2	12,7±0,2	4,0±0,3
Глюкоза 1 % + гуматы 0,5 %	4,0±0,2	33,5±0,2	24,5±0,3	4,1±0,2
Глюкоза 1 % + гуматы 1 %	4,0±0,2	8,8±0,3	17,1±0,2	3,3±0,2
Глюкоза 1 % + меласса 2 %	4,0±0,2	1,5±0,2	15,6±0,4	1,2±0,3
Меласса 1 % + дарина 1 %	4,0±0,2	15,0±0,2	16,1±0,2	2,0±0,2
Меласса 2 % + глицерин 1 %  + дарина 2 %	4,0±0,2	3,8±0,2	6,6±0,2	1,8±0,3
Меласса 0,5 % + глицерин 1 % + гуматы 0,5 %	4,0±0,2	34,1±0,2	26,0±0,3	6,1±0,1
П р и м е ч а н и е. В питательной среде дополнительно содержится 1 % глицерина.

2. Динамика титра (x109 КОЕ/г) клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae в процессе хранения при внесении добавок в питательную среду и в вермикулит (X±x)
Добавка в вермикулит (добавка в среду)	1 мес	2  мес
Ш т а м м  912
Сахароза 1 % + гуматы 0,5 % + глицерин (–)	54,0±0,3	16,2±0,3
Сахароза 1 % + гуматы 0,5 % + глицерин (дарина 1 %)	96,1±0,2	18,9±0,1
Сахароза 1 % (–)	12,0±0,3	10,1±0,3
Сахароза 1 % (дарина 1 %)	18,2±0,1	8,2±0,4
Ш т а м м  913
Сахароза 1% + гуматы 0,5 % (–)	38,1±0,2	13,0±0,2
– (–)	7,6±0,4	6,8±0,2
Сахароза 1 % + глицерин (–)	12,0±0,2	10,1±0,2
Сахароза 1 % + меласса 2 % (–)	10,4±0,2	4,7±0,1
Сахароза 1 % + меласса 2 % + глицерин (–)	12,8±0,3	8,2±0,1
Сахароза 1 % + меласса 5 % (–)	25,3±0,2	16,3±0,2
П р и м е ч а н и е. Прочерки означают, что добавки не вносили.

При оценке эффекта различных добавок на сохранность быстрорастущих клубеньковых бактерий козлятника в препарате (табл. 2) основным источником углерода служила сахароза (доступный и дешевый ингредиент). Полученные результаты свидетельствуют о возможности подобрать оптимальные сочетания компонентов для производства качественных биопрепаратов, используя вермикулит как носитель.
Наиболее экономична и технологична жидкая форма препарата, представляющая собой ферментационную среду, инокулированную ризобиями, однако ее недостаток — короткий срок хранения: титр бактерий начинает резко снижаться уже через 10-15 сут. В наших опытах численность B. japonicum при выращивании на бобовой среде без добавок служила контролем. Через 3 нед после приготовления препарата титр ризобий по вариантам менялся незначительно и находился в пределах 2,8x10⁹-6,4x10⁹ КОЕ/мл (табл. 3). Через 7 нед различия в титрах стали более выраженными. Так, в контроле титр снизился в 2 раза и составил 2,2x10⁹ КОЕ/мл, в варианте с добавлением 1 % сорбата калия — был немного выше (2,9x10⁹ КОЕ/мл). После 3 мес хранения наименьший титр отмечали в варианте с добавлением в препарат 2 % сорбата калия (ниже контроля). Видимо, продолжительное воздействие повышенной концентрации сорбата калия негативно сказывалось на выживаемости клубеньковых бактерий сои.

 

3. Динамика титра (x109 КОЕ/мл) у клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobiumjaponicum в зависимости от срока хранения при внесении в жидкий препарат питательных и стабилизирующих добавок (X±x)
Вариант	0 сут	3 нед	7 нед	3 мес
Контроль	4,3±0,2	4,3±0,3	2,2±0,3	0,900±0,030
Сорбат калия 1 %	4,3±0,2	3,8±0,3	2,9±0,2	1,900±0,200
Сорбат калия 2 %	4,3±0,2	4,2±0,2	2,1±0,3	0,050±0,010
КМЦ 1 %	4,3±0,2	4,2±0,3	6,3±0,4	1,300±0,200
КМЦ 2 %	4,3±0,2	4,5±0,2	4,8±0,3	2,400±0,300
Сорбат калия + КМЦ (по 1 %)	4,3±0,2	3,5±0,2	4,5±0,3	1,100±0,200
Глицерин 1 %	4,3±0,2	5,5±0,3	5,1±0,2	0,470±0,030
Глицерин 2 %	4,3±0,2	5,2±0,2	3,1±0,2	0,410±0,020
Глицерин 5 %	4,3±0,2	4,9±0,2	2,1±0,3	0,370±0,050
Глицерин + КМЦ (по 1 %)	4,3±0,2	6,4±0,4	3,9±0,2	1,400±0,200
Глицерин + гуматы (по 1 %)	4,3±0,2	2,8±0,2	2,4±0,2	0,040±0,002
П р и м е ч а н и е. КМЦ — карбоксиметилцеллюлоза.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение глицерина приводило к увеличению титра в первые 3 нед хранения (бактерии способны использовать глицерин в качестве источника углеводов) (14), однако затем снижение титра происходило даже быстрее, чем в контроле. Добавление КМЦ вызывало появление пиков численности бактерий, причем концентрация КМЦ влияла на время их наступления. Через 3 нед значительное увеличение титра наблюдали при внесении 1 % глицерина и 1 % КМЦ (6,4x10⁹ КОЕ/мл). Наилучший результат получили в вариантах с 2 % КМЦ и 1 % сорбата калия (титры соответственно 2,4x10⁹ и 1,9x10⁹ КОЕ/мл). Эти компоненты тормозят метаболизм микроорганизмов, в результате чего те длительное время сохраняют жизнеспособность в препарате.
В полевых опытах с соей в различных регионах России показано, что использование биопрепарата на основе вермикулита увеличивало число бобов на растении по сравнению с контролем на 45 %, с биопрепаратом на основе торфа — на 16 % (здесь приведены результаты оценки эффективности разных форм препаратов клубеньковых бактерий на территории Алтайского края) (табл. 4).

Биопрепараты на основе торфа были менее эффективными, чем приготовленные на вермикулите. Возможная причина в том, что опыты закладывали на черноземе, содержащем значительное количество азотных соединений. При обработке семян торфяными биопрепаратами все бактерии довольно быстро «уходят» с носителя и не оказывают должного эффекта. У вермикулитных препаратов переход бактерий с носителя в почву пролонгирован, поскольку частицы вермикулита обладают пористым строением и общая площадь поверхности у них очень высока. Вероятно, через какое-то время при наступлении дефицита элементов питания у растения переход бактерий может ускориться, что положительно скажется на развитии растения. Применение биопрепарата на основе вермикулита увеличивало урожайность семян сои на 21 % по сравнению с контролем. В варианте с дополнительной фоновой дозой азота урожайность была на 32 % выше контрольной. Использование торфяной формы повышало урожайность соответственно на 8 и 20 % по сравнению с вариантом без обработки (то есть наибольшая эффективность биопрепаратов достигается со стартовой дозой N).
Таким образом, изготовление препаратов на основе вермикулита технологичнее и проще (не требует g-стерилизации и проверки качества каждой партии торфа), а полученные формы более стандартизированы и лучше сохраняются. Прибавка урожая при применении этих форм биопрепаратов — 15-40 % от контроля. Они высокоэффективны, благоприятно влияют на почвенное плодородие и экологическую обстановку.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Б е р е с т е ц к и й  О.А.,  Д о р о с и н с к и й  Л.М.,  К о ж е м я к о в  А.П. Эффективность препаратов клубеньковых бактерий в Географической сети опытов. Известия АН СССР, сер. биол., 1987, 5: 670-679.
2. К о ж е м я к о в  А.П.,  Х о т я н о в и ч  А.В. Перспективы применения биопрепаратов ассоциативных азотфиксирующих микроорганизмов в сельском хозяйстве. Бюл. ВИУА (М.), 1997, вып. 110: 4-5.
3. К о ж е м я к о в  А.П.,  Т и х о н о в и ч  И.А. Использование инокулянтов бобовых и биопрепаратов комплексного действия в сельском хозяйстве. Докл. РАСХН, 1998, 6: 7-10.
4. З а в а л и н  А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М., 2005.
5. З а в а л и н  А.А.,  А л м е т о в  Н.С. Применение биопрепаратов и биологический азот в земледелии Нечерноземья. М., 2009.
6. К о ж е м я к о в  А.П. Продуктивность азотфиксации в агроценозах. Микробиол. журн., 1997, 59(4): 22-28.
7. Т и х о н о в и ч  И.А.,  К о ж е м я к о в  А.П.,  Ч е б о т а р ь  В.К. Биопрепараты в сельском хозяйстве. М., 2005.
8. З а в а л и н  А.А.,  Б л а г о в е щ е н с к а я  Г.Г.,  К о ж е м я к о в  А.П. Вклад биологического азота бобовых культур в азотный баланс земледелия России. М., 2007.
9. Х о т я н о в и ч  А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применение препаратов на их основе (метод. реком.). Л., 1991.
10. Y o o n  Y.H.,  P o p e  J.,  W o l f e  J. Freezing stresses and hydration of isolated cell walls. Cryobiology, 2003, 46: 271-276.
11. Герхард Ф.-М. Методы общей бактериологии. М., 1983.
12. Ф р о б и ш е р  М. Основы микробиологии. М., 1965.
13. А ш м а р и н  И.П.,  В а с и л ь е в  Н.Н.,  А м б р о с о в  В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. Л., 1971.
14. Bergey's Manual of systematic bacteriology /D.R. Boone, R.W. Castenholz, D.J. Brenner е.a. (eds.). N.Y., 2005.

 

CREATING NEW FORMS OF GROWTH-STIMULATING MICROBIAL PREPARATIONS AND THEIR PERFORMANCE ON VARIOUS CULTURES

Yu.V. Laktionov, T.A. Popova, О.А. Andreev, R.P. Ibatullina, A.P. Kozhemyakov

Complex studies were performed on the properties of a promising carrier, vermiculite, to create preparation of associative and endosymbiotic bacteria. The optimal combinations of stabilizing, nutritive and protective substrates, providing long-term storage and high efficiency of biopreparation, were dedicated. Improved composition of the liquid form of the product, allowing increased duration of its storage was developed. Preparation manufacturing based on vermiculite is significantly easier than on the basis of peat. The technology is more economical, and the products are highly effective.

Keywords: biopreparation, nodule bacteria, yield, carrier, vermikulit.

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, 196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: Laktionov@pop3.ru, Kojemyakov@rambler.ru

Поступила в редакцию 20 декабря 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

От эксперимента — к практике Всероссийский НИИ селекции и семеноводсва овощных культур Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Всероссийский НИИ cельскохозяйственной биотехнологии РАСХН Биотехнический научно-экспериментальный комплекс "ГосНИИсинтезбелок"