УДК 631.46:579.64:631.8:579.22

БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ АГРОНОМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ СВОЙСТВ БАЦИЛЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ СОЗДАНИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

В.К. ЧЕБОТАРЬ, В.Б. ПЕТРОВ, А.И. ШАПОШНИКОВ, Л.В. КРАВЧЕНКО

На примере штамма Bacillus subtilis Ч-13 (продуцент микробиологического препарата экстрасол) изучили возможность контролировать антагонистическую и фитостимулирующую активность у штаммов эндофитных и ризобактерий с помощью биохимических маркеров — антифунгальных метаболитов и ауксинов, выявляемых методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Такие маркеры штамма позволяют провести его аналитико-биохимическую паспортизацию, поддерживать стабильность физиолого-биохимических свойств, осуществлять экспресс-оценку накопления действующих агентов в партиях биопрепарата.

Ключевые слова: бациллы, эндофитные и ризобактерии, микробиологические препараты, антифунгальные метаболиты и ауксины, высокоэффективная жидкостная хроматография.

 

В заметной степени мировую тенденцию сокращения доз минеральных удобрений и химических пестицидов может обеспечить внедрение высокоэффективных микробиологических препаратов (МБП) (1-5), в том числе на основе полезных эндофитных и ризосферных бактерий (ПЭРБ) (6-8). Основой микробных препаратов обычно служат представители родов Pseudomonas, Arthrobacter,Flavobacterium, Bacillus, Achromobacter, продуцирую-щие различные вторичные метаболиты (9, 10). По сумме полезных свойств особенный интерес представляют бациллы, составляющие в зависимости от группы природных и хозяйственных факторов от 30 до 36 % микробной ризосферной и эндофитной популяции агроценоза (11, 12). К полезным свойствам относится биологическая азотфиксация, которая осуществляется бактериями на поверхности и в тканях высшего растения без образования морфологически выраженных структур (8). К активным диазотрофам относятся бациллы, причем некоторые, в частности Вacillus polymyxa, могут интенсивно фиксировать азот в анаэробных условиях, характерных для эндофитных экологических ниш (13, 14). Многие ПЭРБ способны синтезировать фитогормоны — ауксины, гиббереллины, цитокинины, этилен и др. (15, 16), а также необходимые для развития растений витамины (фолиевая кислота, фенилаланин, биотин, тиамин, никотиновая кислота, В6, В12) (17, 18). Бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду функционально различающиеся группы ферментов, лизирующие клеточные стенки фитопатогенных грибов: протеазы, манназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, глюканазы, хитиназы (19). У Bас. subtilis обнаружена способность лизировать клетки других бактерий и грибов. Литические ферменты бацилл обладают различной субстратной специфичностью. При лизисе может высвобождаться содержимое гиф, которое служит дополнительным источником питания и энергии для бацилл (20). Многие ПЭРБ продуцируют антибиотики различной природы, угне-тающие жизнедеятельность фитопатогенных грибов и бактерий (21-28). Наиболее активно синтез протекает в начале стационарной стадии роста (10, 29), что повышает достоверность данных экспресс-диагностики антифунгальной эффективности штаммов. Еще один из распространенных механизмов биоконтроля — индуцированный иммунитет (способность микроорганизмов вызывать устойчивость к болезням и вредителям при стимуляции системных защитных реакций растения) (30). Его выделяют в самостоятельное перспективное направление использования ПЭРБ в растениеводстве (31-32).  
Из выявленного потенциально полезного биоразнообразия в России в виде биопрепаратов используется не более 20 штаммов ПЭРБ (33) (во многом потому, что создание МБП традиционно сопряжено с длительными трудоемкими процедурами скрининга и тестирования свойств, в которых современные биохимические методы, позволяющие в целом ускорить процесс и повысить объективность оценки, используются недостаточно).
Цель настоящей работы — показать возможности использования методов лабораторного исследования для выявления и изучения хозяйственно ценных качеств полезных эндофитных и ризосферных бактерий на примере апробированного в производственных условиях бациллярного препарата комплексного действия экстрасол.  
Методика.Объектом исследования служил продуцент экстрасола (биопрепарат комплексного действия,№ государственной регистрации 0680-07-208-216-0-0-0-1) — Bacillus subtilis Ч-13, изолированный из чернозема в Республике Молдова (34). Анализ антифунгальной активности живой бактериальной культуры против фитопатогенных грибов и бактерий проводили стандартным методом колодцев (35, 36). Для лабораторного изучения продукции антибиотиков бактерии выращивали стационарно на картофельной среде, для анализа ауксинов — на минимальной минеральной среде с содержанием L-триптофана 10 мг/л (среда-стандарт) на качалке при 28 °С в течение 4 сут. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием, культуральные жидкости (КЖ) обрабатывали этилацетатом, экстракт выпаривали под вакуумом (36). Антифунгальную активность экстрактов также определяли методом колодцев. Полученные пробы анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Антифунгальные метаболиты и ауксины разделяли на колонке с обращенной фазой mBondapak C18 («Waters», США), содержание антифунгальных веществ и ауксинов во фракциях обнаруживали по поглощению при λ = 280 нм (выявленная ранее для аналогичных целей эффективная длина волны) (36). Индивидуальные пики в пробах метаболитов после хроматографического разделения экстракта культуральной жидкости собирали, концентрировали на роторном испарителе и анализировали на активность против гриба Fusariumgraminearum. Идентификацию ауксинов проводили сравнением времен удержания и УФ-спектров поглощения соответствующих веществ в пробах и в стандартной смеси. Количество ауксинов определяли сопоставлением площади пиков в пробах и стандартной смеси заданной концентрации. Анализ ауксинов в пробах проводили на системе серии JASCO LC-900 HPLC («Jasco», Япония). Для идентификации ауксинов использовали комбинированный анализ с использованием УФ-детектора UV-975 (Ltd.Untest-B, США) и флуоресцентного детектора FP-920 (Ltd.Untest-B, США). Для оценки способности живой культуры бацилл к фитостимуляции проводили биотест с хлореллой Chlorella vulgaris(штамм 157) методом колодцев на агаризованной среде Хата. Наличие стимулирующего эффекта вокруг лунок с бактериальной суспензией устанавливали по усилению роста хлореллы.
Данные обрабатывали статистически с помощью программы STATISTICA V-5 (StatSoft, Inc., США). Представлены средние арифметические значения со стандартным отклонением.

1. Показатели ингибирования гриба Fusariumgraminearum культурой штамма-продуцента Bacillussubtilis Ч-13 на агаризованной среде

Вариант

Разведение

Зона ингибирования

диаметр,
мм

описание активности

Контроль (стерильная
картофельная среда)

Нет

0

 

Живая культура

Нет

31±4,0

Четкая

Культуральная жидкость

Нет

12±2,0

Слабая

Экстракт метаболитов

1:10

14±2,0

Средняя при всех разведениях

1:100

15±2,0

1:1000

15±2,0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Результаты. Анализ антифунгальной активности Bас. subtilis Ч-13 показал, что наибольшую ингибирующую активность проявляет живая бактериальная культура (табл. 1). Антифунгальная активность культуральной жидкости после отделения бактериальных клеток и суммарной фракции экстрагированных метаболитов была соответственно в 2,0 и 2,5 раза ниже, чем у живой культуры. Следовательно, значительный вклад в антагонистическую активность вносят экзоферменты, продуцируемые живым штаммом Ч-13 и/или его антифунгальные метаболиты in vivo нестабильны.


Высокоэффективная жидкостная хроматография метаболитов штамма Bacillussubtilis Ч-13 (1-9). Пики № 3 и № 5 соответствуют метаболитам с выраженной антифунгальной активностью.

 Хроматографический анализ этилацетатного экстракта КЖ выявил наличие группы пиков со временем выхода 33,86-50,97 мин (рис. 1). Девять наиболее активных фракций были собраны для дальнейшего анализа. Максимальную OD280 имело соединение, соответствующее пику 41,81 мин (пик  № 5). Наиболее выраженную антифунгальную активность выявили у этой фрак-ции. Соответствующее пику вещество в растворе имело желто-зеленое окрашивание. Компоненты со временем выхода 36,63 мин (пик ¹ 3) и 38,82 мин (пик № 4) проявляли слабую, нечеткую активность, остальные шесть фракций были неактивны. Пики с антифунгальным действием имели сильное поглощение, что характерно для сложных органических молекул с фенольными кольцами и гетероциклическими группами.
Суммарная антифунгальная активность содержащихся в КЖ водорастворимых метаболитов составляла примерно 50 % от суммарной активности живой культуры. Характерно, что концентрированный этилацетатный экстракт был активен даже при разведении 1:1000 (см. табл. 1). При тестировании штамм обладал широким спектром действия против различных возбудителей болезней растений. Характерные зоны ингибирования роста бактерий и грибов составляли (мм) для Erwinia carotovora — 28,4±2,0; Pseudomonas syringiae8300 — 32,0±2,6; Pseudomona ssyringiae2314 — 48,0±3,3; Erwinia carotovora3391 — 49,5±4,1; Clavibacter michiganense17-1— 36,0±2,7; Phytophthora capsici— 48,1±3,2; Rhizoctonia solani — 29,6±1,9; Fusarium culmorum — 33,0±2,4; F. solani— 23,8±1,9; F. graminearum — 31,0±2,0  и  Pythium spp.— 38,1±2,9.
Эффективность действия антагонистических механизмов продуцента экстрасола, используемого в качестве протравителя семян, подтвердили в производственных опытах на яровой пшенице (табл. 2), при этом биологическая эффективность экстрасола и химических фунгицидов против корневых гнилей оказалась сопоставимой (34), а экономическая — выше.
Многие штаммы ПЭРБ выделяют в ризосферу индолилуксусную кислоту (ИУК), метаболическим предшественником которой служит L-триптофан (26). Корневые выделения растений могут содержать количества L-триптофана, достаточные для синтеза ауксинов ризо-

2. Средние показатели биологической эффективности химических и микробиологических препаратов, используемых в качестве протравителей семян яровой пшеницы сорта Саратовская 36 (производственный опыт, Республика Татарстан, 2001 год)

Препарат

Корневая гниль, %

Биологическая эффективность, %

распространение

развитие

Контроль

44

10,9

 

Премис 200а

5

1,2

89

Феразима

8

2,1

81

Колфуго дуплета

10

2,5

77

Экстрасолб (Bacillus subtilis Ч-13)

9

2,3

79

Фитоспоринб (Bacillus subtilis  26D, ВНИИСХМ 128)

15

3,7

66

Планризб

17

4,2

62

П р и м е ч а н и е. а — химические, б — микробиологические препараты (в скобках приведены штаммы, на основании которых они изготовлены).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

бактериями. Зная состав корневых выделений и эффективность бактериального биосинтеза ауксинов, можно подбирать пары, в которых фитостимулирующий потенциал ризобактерий будет раскрыт наиболее полно (37).
ВЭЖХ-анализ ауксинов в КЖ Bас. subtilis Ч-13 (табл. 3) выявил продукцию индолил-3-молочной кислоты (ИМК), индолил-3-карбоновой кислоты (ИКК), индолил-альдегида (ИА) и ИУК. Наиболее интенсивно продуцировался ИА, доля ИМК, ИКК и ИУК составляла соответственно 18,4; 6,7 и 7,8 % от общего количества синтезируемых ауксинов. Следовательно, штамм Bас.subtilis Ч-13 значительно более активно продуцирует не основной фитогормон, определяющий фитостимуляцию (ИУК), а другие производные. Суммарная степень использования L-триптофана для биосинтеза ауксинов достигала 5,3 %. Таким образом, фитостимулирующая активность штамма Ч-13 может проявляться при благоприятных условиях роста бациллы как в ризосфере, так и за счет накопления фитогормонов в культуральных средах биопрепаратов (34, 36).

3. Биосинтез ауксинов штаммом Bacillussubtilis Ч-13 при росте на среде с L-триптофаном

Ауксин

Концентрация, нмоль/мл (Х±х)

Использование L-триптофана, %

Индолил-3-молочная кислота

0,68±0,08

1,0

Индолил-3-карбоновая кислота

0,25±0,04

0,4

Индолил-альдегид

2,48±0,35

3,5

Индолил-3-уксусная кислота

0,29±0,05

0,4

Суммарное содержание

3,70

5,3

Биотест на хлореллевыявилстимулирующую активность только в варианте с живой культурой штамма Ч-13. Интересно, что при этом вещества, определяющие стимулирующую активность изучаемого штамма, не являются ауксинами и цитокининами, так как аналогичный биотест с внесением ИУК и зеатина в концентрациях от 20 до 10-3 мкг/мл не стимулировал рост хлореллы.
 Итак, фитостимулирующая и биоконтрольная эффективность бациллярного препарата экстрасол, установленная в процессе многолетних производственных испытаний, подтверждена объективной оценкой соответствующей активности штамма-про-дуцента Bacillus subtilis Ч-13 при помощи лабораторных биотестов и анализа его метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): штамм синтезирует антифунгальные вещества, а при росте на минеральной среде с L-триптофаном продуцирует ауксины. Поскольку синтез антифунгальных и фитостимулирующих агентов исходит одновременно, можно предположить возникновение фитостимулирующего синергетического эффекта практически сразу после введения бациллярных препаратов в агрофитоценоз. Использование выявленных антифунгальных метаболитов и ауксинов в качестве биохимических маркеров штамма позволяет провести его аналитико-биохимическую паспортизацию, контролировать стабильность физиолого-биохимических свойств, осуществлять экспресс-оценку накопления действующих агентов в партиях биопрепарата методом ВЭЖХ.

Л И Т Е Р А Т У Р А
 
1. Биопрепараты в сельском хозяйстве (Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве). М., 2005.
2. П е т р о в  В.Б.,  Ч е б о т а р ь  В.К.,  К а з а к о в  А.Е. Микробиологические препараты в биологизации земледелия России. Достижения науки и техники АПК, 2002, 10: 16-20.
3. C o m p a n t  S.,  D u f f y  B.,  N o w a k  J. e.a. Use of PGPR for biological control of plant diseases: principles, mechanisms of action and future prospects. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 9: 4951-4959.
4. K l o e p p e r  J.W. Plant growth-promoting rhizobacteria as biological control agents. In: Soil microbial ecology /F.B. Metting, Jr. (ed.). Marcel Dekker, N.Y., 1993: 255-274.
5. O k o n  Y.,  L a b a n d e r a - G o n z a l e z  C. Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation experiments. Soil Biol. Biochem., 1994, 26: 1591-1601.
6. W h i p p s  J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J. Exp. Bot., 2001, 52: 487-511.
7. M o n t e s i n o s  E. Development, registration and commercialization of microbial pesticides for plant protection. International Microbiology, 2003, 6: 245-252.
8. Т и х о н о в и ч  И.А.,  П р о в о р о в  Н.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем. Усп. cовр. биол., 2007, 4: 339-357.
9. H a n d e l s m a n  J.,  S t a b b  E.V. Biocontrol of soilborne plant pathogens. Plant Cell, 1996, 8: 1855-1869.
10-. R a a i j m a k e r s  J.M.,  V l a m i  M.,  D e  S o u z a  J.T. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 1-4: 537-547.
11. L y n c h  J.M. The rhizosphere. John Wiley and Sons, Chichester, England, 1990.
12. D a r b y s h i r e  J.F.,  G r a v e s  M.P. Bacteria and protozoa in the rhizosphere. Pestic. Sci., 1973, 4: 349-360.
13. W i t z  D.B.,  D e t r o y  R.W.,  W i l s o n  P.W. Nitrogen fixation by growing cells and cell-free extracts of the Bacillaciae. Arch. Microbiol., 1967, 4: 369-381.
14. К а р п у н и н а  Л.В. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при взаимодействии с растением /Под ред. В.В. Игнатова. М., 2005.
15. F r a n k e n b e r g e r  W.T.,  A r s h a d  M. Phytohormones in soil: microbial production and function. N.Y., 1995.
16. T i m m u s k  S.,  N i c a n d e r  B.,  G r a n h a l l  U.,  T i l l b e r g  E. Cytokinin production by Paenibacillus polymyxa. Soil Biol. Biochem., 1999, 31: 847-1852.
17. N u r m i k k o  V.,  S o i n i  J.,  A a e r i m a a  O. Formation of folate enzymes during the growth cycle of bacteria. 3. Changes in tetrahydrofolate dehydrogenase activity during the active growth phases of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus arabinosus. Acta Chemica Scandinavica, 1965, 19: 129-134.
18. Y o u h  H.H.,  S t o n e  E.E.,  W a t s o n  L. Taxonomic variation in the subunit amino acid compositions of R and BP carboxylases from grasses. Phytochemistry, 1982, 21: 71-80.
19. K a p u l n i k  Y. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. In: Plant root: the hidden half /Y. Waisel, A. Eshel, U. Kafkafi (eds.). N.Y., Basel, Hong Kong, 1996: 769-780.
20. N i e l s e n  P.,  S o r e n s e n  J. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizosphere. FEMS Microbiol. Ecol., 1997, 22: 183-192.
21. С м и р н о в  В.В.,  Р е з н и к  С.Р.,  В а с и л е в с к а я  И.А. Спорообразующие аэробные бактерии — продуценты биологически активных веществ. Киев, 1982.
22. K o u m o u t s i  A.,  C h e n  X.-H.,  H e n n e  A. e.a. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42. J. Bacteriol., 2004, 4: 1084-1096.
23. M i l n e r  J.L.,  S i l o - S u h  L.,  L e e  J.C. Production of kanosamine by Bacillus cereus UW85. Appl. Environ. Microbiol., 1996, 8: 1267-1271.
24. S i l o - S u h  L.A.,  S t a b b  E.V.,  R a f f e l  S.J. e.a.Biological activities of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereus UW85. Appl. Environ. Microbiol., 1994, 6: 2023-2030.
25. G r o o m e  P.C.,  T a t t a r  T.A.,  M o u n t  M.S. Bacillus megaterium: A possible biocontrol organism against Cryphonectria parasitica on American chestnut. Phytopathology, 1999, 89: 100.
26. L e i f e r t  C.,  L i  H.,  C h i d b u r e e  S. e.a. Antibiotic production and biocontrol activity by Bacillus subtilis CL27 and Bacillus pumilus CL45. J. Appl. Bacteriol., 1995, 78: 97-108.
27. D u i t m a n  E.H.,  H a m o e n  L.W.,  R e m b o l d  M. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase. Genetics, 1999, 23: 13294-13299.
28. S c h i s l e r  D.A.,  S l i n i n g e r  P.J.,  B e h l e  R.W. The nature and application of  biocontrol microbes: Bacillus spp. — formulation of Bacillus spp. for biological control of plant diseases. Phytopatology, 2004, 94: 1267-1271.
29. H a a s  W.,  S h e p a r d  B.D.,  G i l m o r e  M.S. Two-component regulator of Enterococcus faecalis cytolysin responds to quorum-sensing autoinduction. Nature, 2002, 415(6867): 84-87.
30. V a n  L o o n  L.C.,  B a k k e r  P.A.H.M.,  P i e t e r s e  C.M.J. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol., 1998, 36: 453-483.
31. B a c k m a n  P.A.,  W i l s o n  M.,  M u r p h y  J.F. Bacteria for biological control of plant diseases. In: Environmentally safe approaches to crop disease control /N.A. Rechcigl, J.E. Rechcigl (eds.). Boca Raton, Florida, 1997: 95-109.
32. B r o a d b e n t  P.,  B a k e r  K.F.,  F r a n k s  N.,  H o l l a n d  J. Effect of Bacillus spp. on increased growth of seedlings in steamed and untreated soil. Phytopathology, 1997, 67: 1027-1031.
33. П е т р о в  В.Б.,  Ч е б о т а р ь  В.К. Микробиологические препараты в практическом растениеводстве России: функции, эффективность, перспективы. Рынок АПК, 2009, 7: 16-18.
34. Ч е б о т а р ь  В.К.,  З а в а л и н  А.А.,  К и п р у ш к и н а  Е.И. Эффективность применения биопрепарата экстрасол. М., 2007.
35. К р а в ч е н к о  Л.В.,  М а к а р о в а  Н.М.,  А з а р о в а  Т.С. и др. Выделение и фенотипическая характеристика ростстимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов. Микробиология, 2002. 4: 521-525.
36. C h e b o t a r’  V.K.,  M a k a r o v a  N.M.,  S h a p o s h n i k o v  A.I. e.a. Antifungal and phytostimulating characteristics of Bacillussubtilis Ch-13 rhizospheric strain, producer of bioprepations. Appl. Biochem. Microbiol., 2009, 4: 419-423.  
37. К р а в ч е н к о  Л.В.,  А з а р о в а  Т.С.,  М а к а р о в а  Н.М. и др. Роль триптофана в корневых экзометаболитах для фитостимулирующей активности ризобактерий. Микробиология, 2004, 2: 195-198.

 

BIOCHEMICAL CRITERIA FOR ESTIMATION OF AGRONOMIC VALUABLE PROPERTIES OF BACILLI USED FOR DEVELOPMENT OF MICROBIAL PREPARATIONS

V.К. Chebotar’, V.B. Petrov, A.I. Shaposhnikov, L.V. Kravchenko

Studying strain Bacillus subtilis Ch-13, which is used as a producer of microbial preparation extrasol, the agronomical valuable properties of endophytic and rhizobacteria was shown to be revealed and controlled by modern biochemical markers. Antifungal metabolites and auxins synthesized by living culture of B. subtilis Ch-13 make the significant contribution in antagonistic and phytostimulation activity of extrasol. Using these metabolites as biochemical markers allows to provide analytical and biochemical certification, to monitor the stability of physiological and biochemical properties of the strain, to carry out a rapid assessment of the accumulation of active agents in batch of biological preparation.

Keywords: bacilli, endophytic and rhizobacteria, microbial preparation, agronomically valuable properties, antifungal metabolites and auxins, method HPLC.

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,

196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: petrogard@mail.ru

Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало