doi: 10.15389/agrobiology.2023.2.313rus
УДК 636.52/.58:591.1:579.2:577.2
Исследование выполнено по гранту Российского научного фонда №22-66-00061 «Экспрессия генов продуктивности и резистентности кур нового отечественного кросса «Смена 9» и ее влияние на иммунитет, особенности реализации генетического потенциала продуктивности при разном энерго-аминокислотном питании».
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ИММУНИТЕТА И АДАПТАЦИИ И СОСТАВ МИКРОБИОМА У РОДИТЕЛЬСКОГО ПОГОЛОВЬЯ КУР И ПЕТУХОВ (Gallus gallus L.) ЛИНИЙ СМ5 И СМ9 КРОССА СМЕНА 9
Г.Ю. ЛАПТЕВ1, Е.А. ЙЫЛДЫРЫМ1, 2 ✉, Л.А. ИЛЬИНА1, 2,
В.А. ФИЛИППОВА1, 2, К.А. КАЛИТКИНА1, Е.С. ПОНОМАРЕВА1,
А.В. ДУБРОВИН1, Д.Г. ТЮРИНА1, В.И. ФИСИНИН3, И.А. ЕГОРОВ3,
Т.А. ЕГОРОВА3, В.А. МАНУКЯН3, Т.Н. ЛЕНКОВА3
Породы корниш и плимутрок составляют основу современных специализированных мясных кроссов кур. Селекция отцовской линия породы корниш СМ5 нового российского кросса мясных кур Смена 9 ведется в основном по признакам мясной продуктивности, тогда как материнская линия породы плимутрок СМ9 — прежде всего на эффективность репродукции и жизнеспособность при более низкой, чем у линии СМ5, скорости роста живой массы. В настоящем исследовании мы впервые выявили у кур и петухов родительского поголвья линий СМ5 и СМ9 нового кросса Смена 9 различия, связанные с генотипом и полом, в экспрессии некоторых генов иммунитета и генов, связанных с адаптационным потенциалом, а также в составе и прогнозируемом функциональном потенциале микробиома. Целью работы было сравнение уровня экспрессии генов иммунитета и генов, связанных с адаптационным потенциалом, соответственно в тканях бурсы в печени, а также состава и функций микробиома слепых отростков кишечника у кур и петухов линий СМ5 и СМ9. Эксперименты проводили в виварии СГЦ «Загорское ЭПХ» (Московская обл., 2022 год) на родительском поголовье кур и петухов линий СМ5 и СМ9 39-недельного возраста, содержавшихся в идентичных условиях и получавших одинаковый рацион. От каждой линии и пола отбирали образцы тканей у 5 особей с близкой живой массой. Анализ экспрессии генов в образцах тканей проводили с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Тотальную РНК выделяли с помощью мини-набора Aurum™ Total RNA («Bio-Rad», США). ПЦР-амплификацию проводили с использованием SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix («Bio-Rad», США) и детектирующего амплификатора ДТлайт (НПО «ДНК-Технология», Россия). В тканях печени проводили анализ экспрессии генов, связанных с адаптационным потенциалом: гены CAT1 транспортера катионных аминокислот 1, HSF1 и HSF2 — факторов транскрипции белков теплового шока 1 и 2, SOD — супероксиддисмутазы, Gpx1 — глутатионпероксидазы, HO-1 — гемоксигеназы-1. В тканях бурсы анализировали экспрессию генов, связанных с иммунитетом: гены IL8 — интерлейкина-8, IRF7 — регуляторного фактора интерферона 7, PTGS2 — простагландин-эндопероксидсинтазы, AvBD1, AvBD2, AvBD9 и AvBD10 — β-дефензины 1, 2, 9 и 10, Casp6 — каспазы 6. В качестве референсного контроля использовали праймер для гена β-актина (ACTB). Относительный уровень экспрессии оценивали методом 2-ΔΔCT. Тотальную ДНК для анализа состава микробиома выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Бактериальное сообщество слепой кишки оценивали методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с праймерами для V3-V4 региона гена 16S рРНК. Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома, семейств генов, ферментов осуществляли при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v. 2.3.0). Математическую и статистическую обработку результатов осуществляли методом многофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в программах Microsoft Excel XP/2003 и R-Studio (v. 1.1.453). Полученные результаты показали увеличение экспрессии генов HSF1 и HSF2 у петухов линии СМ5 по сравнению с остальными группами (р ≤ 0,05), в часности, разница с петухами линии СМ9 составляла соответственно 68 и 218 % (р ≤ 0,05). Экспрессия генов HSF1 и HSF2 внутри линии СМ5 у петухов была выше соответственно в 1,6 и 3,0 раза, чем у кур (р ≤ 0,05). Наблюдалась существенная активация экспрессии генов антимикробных пептидов и провоспалительных генов у петухов линии СМ9 по сравнению с петухами и курами линии СМ5 (р ≤ 0,05). Так, экспрессия генов AvBD2, AvBD9, AvBD10, IL8 и PTGS2 у петухов линии СМ9 по сравнению с петухами линии СМ5 усиливалась соответственно в 7,6; 5,3; 2,1; 6,3 и 1,5 раза (р ≤ 0,05). NGS-секвенирование показало, что в микробиоме слепых отростков кишечника у кур и петухов линии СМ9 присутствовали бактерии суперфилума Elusimicrobiota (соответственно 0,32±0,11 и 0,49±0,19 %), при этом у петухов линии СМ5 эти микроорганизмы не были выявлены, а у кур линии СМ5 их доля составляла 0,04±0,01 %. Между группами были обнаружены достоверные (р ≤ 0,05) различия по 25 родам, у части родов — в зависимости от генотипа, у части — от пола птицы. Например, у петухов линии СМ5 обилие микроорганизмов родов Barnesiella, Clostridia_UCG-014 и Frisingicoccus было соответственно в 17,2; 2,0 и 4,9 раза выше (р ≤ 0,05), чем у петухов линии СМ9. Представители рода Desulfovibrio присутствовали в кишечнике петухов линий СМ5 и СМ9 (0,25±0,08 и 0,73±5,6 %); при этом в кишечнике кур обеих линий этих микроорганизмов мы не обнаружили. По результатам биоинформатической реконструкции и функциональной аннотации данных NGS-секвенирования в микробном сообществе кишечника выявлены 357 прогнозируемых метаболических путей, по 65 из которых наблюдались различия (р ≤ 0,05) между группами. Специфические для генотипа и пола модуляции в экспрессии генов, а также в структуре и функциях кишечного микробиома могут обеспечивать адаптацию макроорганизма в изменяющихся условиях.
Ключевые слова: бройлерный кросс, Смена 9, слепые отростки кишечника, микробиом, NGS-секвенирование, прогнозируемые метаболические пути, экспрессия генов, иммунитет, адаптации, бурса, печень.
G.Yu. Laptev1, E.A. Yildirim1, 2 ✉, L.A. Ilyina1, 2, V.A. Filippova1, 2,
K.A. Kalitkina1, E.S. Ponomareva1, A.V. Dubrovin1, D.G. Tyurina1,
V.I. Fisinin3, I.A. Egorov3, T.A. Egorova3, V.A. Manukyan3, T.N. Lenkova3
The Cornish and Plymouthrock breeds form the basis of modern specialized meat crosses of chickens. The selection of the paternal line of the Cornish CM5 breed of the new Russian cross of meat chickens Smena 9 is carried out mainly on the basis of meat productivity, while the maternal line of the Plymouthrock CM9 breed is primarily for reproductive efficiency and viability at a lower live growth rate than that of the CM5 line masses. In the present study, we revealed for the first time that hens and roosters of the parent stock of lines CM5 and CM9 of the novel cross Smena 9 differ in the expression of some immunity and adaptation genes, as well as in the composition of the microbiome and its putative metabolic pathways. Differences are related to genotype and sex. The aim of the work was to compare the level of expression of immunity genes and genes associated with adaptive potential, respectively, in the tissues of the bursa in the liver, as well as the composition and functions of the microbiome of the caecum of the intestine in chickens and roosters of the CM5 and CM9 lines. The experiments were carried out in the vivarium of the Zagorsk EPH (Moscow Province, 2022) on the parent stock of chickens and roosters of the CM5 and CM9 lines of 39 weeks of age, kept under identical conditions and receiving the same diet. From each line and gender, tissue samples were taken from five individuals with a close live weight. Analysis of gene expression in tissue samples was performed using quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). Total RNA was isolated using the Aurum™ Total RNA mini kit (Bio-Rad, USA). PCR amplification was performed using SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, USA) and a detecting amplifier DTlight (DNA-Technology, Russia). In the liver tissues, we analyzed the expression of genes associated with the adaptive potential: genes CAT1 of the transporter of cationic amino acids 1, HSF1 and HSF2 — transcription factors of heat shock proteins 1 and 2, SOD — superoxide dismutase, Gpx1 — glutathione peroxidase, HO-1 — heme oxygenase-1. In the tissues of the bursa, the expression of genes associated with immunity was analyzed: genes IL8 — interleukin-8, IRF7 — regulatory factor interferon 7, PTGS2 — prostaglandin endoperoxide synthase, AvBD1, AvBD2, AvBD9 and AvBD10 — β-defensins 1, 2, 9 and 10, Casp6 — caspase 6. A primer for the β-actin gene (ACTB) was used as a reference control. The relative level of expression was assessed by the 2-ΔΔCT method. Total DNA for analysis of the composition of the microbiome was isolated using the Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The caecal bacterial community was assessed by NGS sequencing on the MiSeq platform (Illumina, Inc., USA) with primers for the V3-V4 region of the 16S rRNA gene. The reconstruction and prediction of the functional content of the metagenome, gene families, and enzymes was carried out using the PICRUSt2 software package (v. 2.3.0). Mathematical and statistical processing of the results was carried out by the method of multivariate analysis of variance (ANOVA) in Microsoft Excel XP/2003 and R-Studio (v. 1.1.453). The results obtained showed an increase in the expression of the HSF1 and HSF2 genes in CM5 cocks compared to other groups (p ≤ 0.05), in particular, the difference with CM9 cocks was 68 and 218 %, respectively (p ≤ 0.05). The expression of the HSF1 and HSF2 genes within the CM5 line in roosters was 1.6 and 3.0 times higher, respectively, than in hens (p ≤ 0.05). Significant activation of the expression of antimicrobial peptides and pro-inflammatory genes occurred in CM9 cocks compared to CM5 cocks and hens (p ≤ 0.05). The expression of AvBD2, AvBD9, AvBD10, IL8 and PTGS2 genes in CM9 cocks increased 7.6-, 5.3-, 2.1-, 6.3- and 1.5-fold (p ≤ 0.05), respectively, compared to CM5 cocks. NGS sequencing showed that the microbiome of the caecum of the CM9 hens and roosters contained bacteria of the superphylum Elusimicrobiota (0.32±0.11 and 0.49±0.19 %, respectively). These microorganisms did not occur in CM5 roosters while in the SM5 hens, their proportion was 0.04±0.01 %. Significant (p ≤ 0.05) differences were found between the groups in 25 genera, in some genera, it depends on the genotype, in others — on the sex of the bird. For example, in cocks of the CM5 line, the abundance of microorganisms of the genera Barnesiella, Clostridia_UCG-014 and Frisingicoccus was 17.2, 2.0 and 4.9 times higher (p ≤ 0.05), respectively, than in males of the CM9 line. Members of the genus Desulfovibrio were present in the intestines of CM5 and CM9 cocks (0.25±0.08 and 0.73±5.6 %). However, we did not find these microorganisms in the intestines of hens of both lines. Based on the results of bioinformatics reconstruction and functional annotation of NGS sequencing data, we identified 357 putative metabolic pathways in the gut microbial community, 65 of which differed (p ≤ 0.05) between test groups. Genotype- and sex-specific modifications in gene expression, as well as in the structure and function of the gut microbiome, may provide adaptation of a macroorganism under changing conditions.
Keywords: broiler cross, Smena 9, caecum, microbiome, NGS sequencing, predicted metabolic pathways, gene expression, immunity, adaptations, bursa, liver.
1ООО «БИОТРОФ+», |
Поступила в редакцию |
