doi: 10.15389/agrobiology.2022.2.356rus
УДК 579.6:579.25
Работа выполнена в рамках государственного задания НИОКТР АААА-А19-119112290009-1 и научного проекта С-26/792.
ВОЗБУДИТЕЛИ КОЛИБАКТЕРИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ — НОСИТЕЛИ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ ЭКСТРАИНТЕСТИНАЛЬНЫХ И КИШЕЧНЫХ Escherichia coli
Ю.С. ПОСПЕЛОВА1 ✉, M. STARČIČ ERJAVEC2, М.В. КУЗНЕЦОВА1
С расширением объемов производства в птицеводстве и интенсификацией отрасли возрастает угроза распространения колибактериоза среди сельскохозяйственной птицы, поэтому существует острая необходимость в мониторинге птичьих патогенных Escherichia coli (avian pathogenic Escherichia coli, APEC), изучении генетического разнообразия последних и выявлении штаммов, представляющих опасность для здоровья человека. Определение генов, ассоциированных с вирулентностью, и степени специфической адгезии может быть полезным в комплексной оценке эпидемической и эпизоотической значимости штаммов E. coli, выделенных от сельскохозяйственных животных. В настоящей работе по результатам комплексного молекулярного скрининга штаммов E. coli, выделенных от птиц во время вспышек колибактериоза, на наличие у них генов различных патотипов эшерихий впервые показано, что штаммы характеризовались высоким потенциалом патогенности и могли быть носителями генов сразу нескольких патотипов, при этом детерминанты кишечных патогенных E. coli (IPEC) встречались чаще других. Позитивный адгезивный профиль по ряду генов положительно коррелировал с уровнем адгезии штаммов к эритроцитам кур (Gallus gallus L.) и человека. Цель работы — дать генотипическую характеристику штаммов E. coli,выделенных от сельскохозяйственной птицы с колибактериозом, а также оценить взаимосвязь между адгезивным генотипом и специфической адгезией к эритроцитам. В работе использовали 28 штаммов E. coli с уникальным генотипом согласно ERIC-ПЦР, выделенных в 2016-2018 годах из разных органов (исключая кишечник) цыплят-бройлеров (Gallus gallus L.) кросса Ross 308 с генерализованным колибактериозом. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по конечной точке детектировали гены вирулентности (n = 28), характерные для четырех условных групп: гены, обеспечивающие патогенность бактерий вида E. coli, встречающиеся у различных патотипов, гены патогенных для птиц E. coli (APEC), кишечных патогенных E. coli (IPEC: EPEC/ETEC/EHEC/EaggEC) и уропатогенных E. coli (UPEC). Протоколы для всех типов ПЦР применяли в их авторских вариантах. Амплификацию проводили на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США). Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с использованием системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). При определении адгезии бактерий к эритроцитам клеточным субстратом служили формалинизированные эритроциты человека 0(I) группы Rh(+) и птичьи эритроциты. Адгезивные свойства клеток оценивали с помощью индекса адгезивности микроорганизма (среднее число бактерий, прикрепившихся к одному эритроциту, участвующему в адгезии). Показано, что культуры были носителями множественных генов вирулентности, характерных для различных патотипов E. coli (APEC, UPEC, IPEC). По генетическому профилю изученные штаммы эшерихий имели большее сходство со штаммами, вызывающими острые кишечные инфекции у человека, чем с уропатогенными E. coli. Наличие специфических маркерных генов позволило идентифицировать большинство штаммов как APEC, которые могут содержать детерминанты патогенности, в частности токсины, характерные для патотипа IPEC (за исключением генов шигаподобных токсинов и энтерогемолизинов). На основании кластерного анализа генетических профилей культуры были отнесены к трем условным группам: патогенные для птиц и человека (наличие одновременно 2-6 генов, связанных с АРЕС, и 2-6 генов, связанных с ExPEC или IPEC; 24 штамма), патогенные для птиц и не патогенные для человека (наличие 2-6 генов, связанных с APEC, и 0-1 гена, связанного с ExPEC или IPEC; 2 штамма) и непатогенные (0-1 ген из любой группы, APEC, ExPEC, IPEC, 2 штамма). Выявлено, что 75 % штаммов, выделенных как патогенные для птиц и человека, характеризовались высокими частотами встречаемости генов вирулентности, острова патогенности SHI-2, а также генов бета-лактамаз расширенного спектра и участков интегронов 1-го класса. Специфическая адгезия штаммов E. coli была более выражена в отношении куриных эритроцитов, чем человеческих. При этом, независимо от типа эритроцитов, высокая адгезивная активность бактерий коррелировала с большей выживаемостью в сыворотке крови хозяина (iss+ генотип) и способностью лизировать эритроциты (hlyF+ генотип). Полученные данные о молекулярных и адгезивных свойствах возбудителей колибактериоза птиц позволяют оценить их зоонозный потенциал и эпизоотическую значимость, а также могут служить основой для усовершенствования системы мониторинга колибактериоза в птицеводческих хозяйствах.
Ключевые слова: патогенные для птиц Escherichiacoli, APEC, IPEC, гены вирулентности, специфическая адгезия, зоонозный потенциал.
J.S. Pospelova1 ✉, M. Starčič Erjavec2, M.V. Kuznetsova1
The expansion and intensification of poultry farming increases the risk of spreading colibacillosis among poultry, so there is an urgent need to monitor avian pathogenic Escherichia coli (APEC), study their genetic diversity and identify strains that pose a threat to human health. Determination of virulence-associated genes and the degree of specific adhesion may be useful for a comprehensive assessment of the epidemic and epizootic significance of E. coli strains isolated from livestock. In this study, an extended molecular analysis of E. coli strains isolated from poultry during outbreaks of colibacillosis was performed with the objective to genotypically characterize the isolated E. coli strains and to evaluate the relationship between genes encoding adhesins and specific adhesion to erythrocytes. It was shown for the first time that the strains were characterized by a high potential for pathogenicity and could be carriers of genes for several pathotypes at once, while the genes of intestinal pathogenic E. coli (IPEC) were detected often than others. A positive adhesive profile for a number of genes correlated positively with the activity of strain adhesion to chicken (Gallus gallus L.) and human erythrocytes. In the study 28 non-clonal E. coli strains, as determined by ERIC-PCR, isolated from various organs (except the intestine) of Ross 308 cross broilers (Gallus gallus L.) with generalized colibacillosis in 2016-2018 were characterized. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect virulence-associated genes characteristic of four different E. coli pathotypes, the APEC, extraintestinal pathogenic (ExPEC), intestinal pathogenic E. coli (IPEC: Enteropathogenic E. coli EPEC, Enterotixigenic E. coli ETEC, Enterohemorrhagic E. coli EHEC, Enteroaggregative E. coli EaggEC), and uropathogenic E. coli (UPEC). Previously published protocols were used for all types of PCRs and amplifications were performed in the DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). Band visualization and data documentation were performed using the Gel-Doc XR gel documentation system (Bio-Rad, USA). Formalinized human erythrocytes of the type 0(I) Rh(+) and avian erythrocytes were used as cell substrates for the determination of bacterial adhesion to erythrocytes. To evaluate the bacterial adhesion properties the adhesion index was calculated as the average number of bacteria bound to an erythrocyte in the adhesion assay. The obtained results showed that the characterized strains possessed a high pathogenic potential, as they carried genes associated with APEC, ExPEC as well as IPEC. The presence of APEC-specific marker genes identified most of the strains as APEC. However, potential for human pathogenicity was also found among the analyzed strains. As the IPEC-associated genes were found more frequently than ExPEC-associated genes, the E. coli strains studied were more similar to strains causing acute intestinal infections in humans, particularly due to the fact that they carried genes encoding toxins characteristic of IPEC (with the exception of genes for Shiga-like toxins and enterohemolysins). Based on cluster analysis of genetic profiles, the strains studied could be classified into three groups: (i) pathogenic to birds and humans, characterized by the presence of 2-6 genes associated with APEC and 2-6 genes associated with ExPEC or IPEC (24 strains), (ii) pathogenic to birds and nonpathogenic to humans, characterized by the presence of 2-6 genes associated with APEC and 0-1 gene associated with ExPEC or IPEC (2 strains), and (iii) nonpathogenic, characterized by the possession of none or one gene from each pathotype, APEC, ExPEC, IPEC (2 strains). It was found that 75 % of the first group, pathogenic to birds and humans, carried not only a high number of virulence-associated genes, but also pathogenicity island SHI-2, as well as genes for extended-spectrum beta-lactamases and class 1 integrons. Specific adhesion of E. coli strains was more pronounced on chicken erythrocytes than on human ones. Statistical analysis revealed several positive correlations between the chicken and human erythrocytes adhesion profiles and a number of genes encoding adhesins. The high adhesion activity of the bacteria, regardless of the type of erythrocyte, also correlated with longer survival in host blood serum (genotype iss+) and the possibility of erythrocyte lysis (genotype hlyF+). The obtained data on the molecular and adhesive properties of causative agents of colibacillosis in birds allow us to assess their zoonotic potential and epizootic significance and can also serve as the basis for improving the monitoring system for colibacillosis in poultry farms.
Keywords: avian pathogenic Escherichia coli, APEC, ExPEC, IPEC, virulence-associated genes, zoonotic potential.
1Институт экологии и генетики микроорганизмов |
Поступила в редакцию |
