doi: 10.15389/agrobiology.2020.2.328rus
УДК 636.5:619:579.62:615.371
РАЗРАБОТКА И ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭНТЕРОКОККОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
Д.Д. СМИРНОВ, А.В. КАПУСТИН, П.Н. ШАСТИН, М.И. ГУЛЮКИН, А.И. ЛАИШЕВЦЕВ
Энтерококкоз птиц — заболевание, которое проявляется поражением органов опорно-двигательной системы и сопровождается хромотой, атаксией, спондилитом, некрозом головки бедренной кости, бактериальным хондронекрозом. Его превалирующий возбудитель на территории Российской Федерации — бактерия Enterococcus cecorum (EC). Заболевание может возникать среди ремонтного молодняка (преимущественно петушков) в возрасте 1-7 нед, товарных бройлеров в возрасте 3-5 нед и у родительского поголовья в период пика продуктивности. В настоящей работе на основании результатов изучения патогенных, антигенных и иммуногенных свойств культур Enterococcuscecorum впервые разработана и апробирована отечественная вакцина против энтерококкоза. В условиях промышленного птицеводческого предприятия было доказано, что разработанное средство безвредно для птицы различных возрастных групп и обладает необходимой протективной эффективностью. Цель исследования — разработка средства специфической профилактики энтерококкоза сельскохозяйственной птицы и оценка эффективности полученного препарата. При изучении эпизоотической обстановки по энтерококкозу птицы в 2017-2018 годах на территории Российской Федерации было установлено неблагополучие на 11 птицеводческих предприятиях в Белгородской, Владимирской, Ярославской, Калужской, Челябинской, Тверской и Пензенской областях, а также в Республиках Мари-Эл и Удмуртия. Всего исследовали 647 проб паренхиматозных органов и тканей, полученных от птицы кросса Cobb 500 с типичным клинико-морфологическим проявлением энтерококкоза.Штаммы E. cecorum №№ 414, 425, 426, 837, 838, 839, 1096, 1481, 1517, 1647, 1865 выделили при комплексной бактериологической диагностике секционного материала. Установлено, что 72,73 % энтерококков были резистентны к ампициллину и пенициллину, 45,45 % — к ванкомицину, 27,27 % — к левофлоксацину, линезолиду, тетрациклину, 18,18 % — к норфлоксацину, рифампицину, хлорамфениколу и ципрофлоксацину, 9,09 % — к доксициклину. Наибольшее число культур оказались чувствительны к гентамицину и левофлоксацину (72,73 %), а также к доксициклину, линезолиду, рифампицину и хлорамфениколу (54,55 %). Все изученные штаммы вызывали гибель 100 % лабораторных белых мышей в течение 24-96 ч после внутрибрюшинного инфицирования. LD50 культур энтерококков составляла 1,7×107-9,4×108 мкр кл. При определении антигенных свойств культур в реакции агглютинации было установлено, что они гомологичны друг к другу, то есть относятся к одному серотипу. Определение количества антител у белых мышей, 2-кратно иммунизированных вакцинами из штаммов № 414 и № 1517, показало, что они обладают наибольшей антигенностью, индуцируя иммунитет (титр специфических антител 1:26,66±9,23), в то время как антигенность других штаммов была ниже (титр антител 1:21,33±9,23 и менее). На основании этого результата штаммы № 414 и № 1517 в последующем использовались как контрольно-производственные. Оценка иммуногенной активности экспериментального препарата на белых мышах показала, что вакцинация обеспечивала сохранность 90 % инфицированных животных, тогда как смертность в контроле составила 100 %. Для обеспечения высокой эффективности разрабатываемого средства необходимо введение 1,5 млрд мкр кл. EС, при этом оптимальный объем однократной дозы равен 0,2 см3. В качестве инактиванта при получении вакцинного препарата использовался формалин (0,3 %), в качестве адъюванта — полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ-6000) из расчета 10 % от объема. Разбавителем служил фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), значение pH вакцины регулировали с помощью 20 % раствора едкого натра до 7,2. Вакцина вызывала формирование иммунитета через 12-14 сут после 2-кратного внутримышечного введения, который сохранялся не менее 4 мес. При проведении клинических испытаний на курах кросса Cobb 500 была установлена безвредность и высокая специфическая эффективность вакцины для птицы. Двукратная вакцинация ремонтного молодняка обеспечивала повышение однородности стада на 4,6 % и снижение общего отхода на 0,13 %. Анализ производственных показателей вакцинированных кур-несушек показал снижение общего отхода на 1,81 % и повышение яичной продуктивности на 1,7 %. После первой вакцинации родительского поголовья титр антител у птицы составил в среднем 1:5,60±2,00 (n = 25), а через 14 сут после второй вакцинации он увеличивался до 1:43,52±15,67, что превышало значение защитного титра антител (1:26,66±9,23). Полученные результаты позволяют обсуждать возможность практического использования разрабатываемого средства на основе штаммов Enterococcus cecorum.
Ключевые слова: Enterococcus cecorum, остеомиелиты, некроз головки бедренной кости, энтерококкозы, клинические признаки, профилактические мероприятия, вакцина, болезни кур.
D.D. Smirnov, A.V. Kapustin, P.N. Shastin, M.I. Gulyukin, A.I. Laishevtcev
Enterococcosis in poultry is a disease which affects the organs of locomotor system and is accompanied by lameness, ataxia, spondylitis, necrosis of the femoral head and bacterial chondronecrosis. The main pathogen of this disease on the territory of the Russian Federation is bacteria of the species Enterococcus cecorum (EC). The disease can occur among young herds for replacement (mainly cockerels) at the age from 1 to 7 weeks; commodity broiler aged 3-5 weeks; and parent stock during peak production. In this work we represent for the first time the results of the development and tests of the domestic means of specific prevention from enterococcosis in poultry. The experimental series of vaccine, tested in industrial environment on poultry, was produced on the basis of the selection of production-control enterococcus species and the measurement of the optimal immunizing dose and adjuvant. The proposed medicine possesses areactogenicity and high specific effectiveness when used for poultry of different age groups. The aim of the work is the development of means of specific prevention from enterococcosis of poultry and evaluation of its effectiveness. The study of the epizootic situation on enterococcosis in poultry on the territory of the Russian Federation in 2017-2018 showed that 11 poultry enterprises in the Belgorod, Vladimir, Yaroslavl, Kaluga, Chelyabinsk, Tver and Penza regions, as well as in the Republics of Mari El and Udmurtia, were enterococcosis positive. All in all, 647 samples of parenchymal organs and tissues obtained from birds of Cobb 500 cross with typical clinical morphological manifestation of enterococcosis were examined. Strains E. cecorum Nos. 414, 425, 426, 837, 838, 839, 1096, 1481, 1517, 1647, 1865 were selected during the complex bacteriological diagnosis of breeding material. It was determined that 72.73 % of enterococci are resistant to ampicillin and penicillin, 45.45 % to vancomycin, 27.27 % to levofloxacin, linezolid, tetracycline, 18.18% to norfloxacin, rifampicin, chloramphenicol and ciprofloxacin, and 9.09% to doxycycline. The largest number of species are sensitive to gentamicin and levofloxacin (72.73 %); doxycycline, linezolid, rifampicin, chloramphenicol (54.55 %), respectively. All the studied strains led to the death of 100 % of laboratory mice within 24-96 hours after intraperitoneal infection. The LD50 of enterococcal cultures was in the range of 1.7×107-9.4×108 microbial cells. When determining the antigenic properties of EC species in the agglutination reaction, it was confirmed that they are all homologous to each other, i.e. belong to the same serotype. Evaluation of the level of antibodies in doubly immunized white mice with vaccines from strains No. 414 and No. 1517 showed that they have the highest antigenicity, inducing immunity in the titer of 1:26.66±9.23, while the antigenicity of other strains was 1:21.33±9.23 and less. Based on this result, strains No. 414 and No. 1517 were subsequently used for control and production. Evaluation of the immunogenic activity of the experimental medicine on white mice showed that the vaccine ensures the safety of 90 % of infected animals, while mortality among the mice of the control group was 100 %. To ensure high efficiency of the developed means, 1.5 billion microbe cells EC are needed, and the optimal amount of a single dose is 0.2 cm3. Formalin (0.3%) was used as an inactivant and polyethylene glycol 6000 (PEG-6000) as an adjuvant at the rate of 10 % v/v. Phosphate-buffered saline (PBS) was used as diluent, the pH level was set to 7.2 with a 20 % sodium hydroxide solution. The vaccine provoked the formation of immunity 12-14 days after a double intramuscular injection, which lasts at least 4 months. Clinical trials on chickens of Cobb 500 cross proved the safety and the high specific effectiveness of the vaccine for poultry. Double vaccination of replacement herds in poultry led to a 4.6 % increase in uniformity and a 0.13 % decrease in total waste. The analysis of production indicators of vaccinated laying hens showed a 1.81 % decrease in total mortality and a 1.7 % increase in egg productivity of. After the first vaccination of the parent livestock, the average antibody level in the bird was 1:5.60±2.00 (n = 25), and 14 days after the second vaccination, the titer reaches 1:43.52±15.67, which exceeds the value of the protective level of antibodies (1:26.66±9.23). The results obtained allow us to talk about the possibility of further implementation of the medicine developed on the basis on Enterococcus cecorum strains in practical use.
Keywords: Enterococcus cecorum, EC, osteomyelitis, femoral head necrosis, enterococcosis, clinical signs, preventive measures, vaccination.
ФГБНУ ФНЦ Всероссийский НИИ экспериментальной |
Поступила в редакцию |
