doi: 10.15389/agrobiology.2020.2.295rus
УДК 636.2:591.39:576.5
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 18-29-07089) и Министерства науки и высшего образования РФ.
РАЗВИТИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА in vitro В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПАРАМЕТРОВ СЛИЯНИЯ И АКТИВАЦИИ
Г.Н. СИНГИНА, А.В. ЛОПУХОВ, Е.Н. ШЕДОВА
Технология получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота имеет широкие перспективы применения для решения задач, направленных на тиражирование высокопродуктивных и уникальных генотипов в племенном животноводстве, а также создание новых генотипов методами геномного редактирования. Известно, что основой успешного клонирования является способность донорского ядра соматической клетки перепрограммироваться в направлении тотипотентного состояния и что соответствующие трансформации ядра клетки (кариопласта) опосредуются факторами цитоплазмы ооцита (цитопласта) и начинаются с момента их объединения (слияния). При этом характер воздействия цитоплазмы зависит от многих факторов и является объектом направленного воздействия. В этой связи в рамках представляемой работы была поставлена цель оценить эффективность клонирования с точки зрения продолжительности воздействия цитоплазмы ооцита на донорское ядро до активации, возраста MII ооцитов на момент их активации в составе слившихся комплексов (цитогибридов), а также повторного электрослияния цитопласта и кариопласта. Изучали воздействие указанных факторов на формирование клонированных эмбрионов и их развитие до стадии бластоцисты. Выделенные post mortem ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) созревали в среде ТС-199, дополненной 10 % фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл фолликулостимулирующего (ФСГ) и 10 мкг/мл лютеинизирующего (ЛГ) гормонов. Через 20-24 ч созревания ОКК обрабатывали 0,1 % раствором гиалуронидазы, механически удаляли кумулюсные клетки и отбирали ооциты с первым полярным тельцем. Фетальные фибробласты (длительного срока хранения) культивировали до сформированного монослоя, контактно ингибировали в течение 2 сут и готовили к процедуре переноса в энуклеированный ооцит в виде суспензии. Для объединения ооцитов и перенесенных в их перивителлиновое пространство клеток применяли два последовательных прямоугольных импульса постоянного тока при напряжении 35 В продолжительностью 20 мкс (однократно или в случае отсутствия признаков объединения клеток двукратно). Полученные цитогибриды активировали иономицином через 1,0 или 2,0 ч после слияния (23-25 или 26-28 ч с момента начала созревания ооцитов-реципиентов) и культивировали до стадии бластоцисты. Доля раздробившихся ооцитов не различалась между экспериментальными группами и варьировала от 60,7 до 70,4 %. Также не различалась доля развития бластоцист, когда использовалось однократное или двукратное слияние (соответственно 29,4±4,4 и 22,8±3,5 %). При интервале между слиянием и активацией 1,0 ч выход бластоцист составлял 17,4±2,6 %. Удлинение продолжительности указанного периода до 2,0 ч повышало этот показатель до 31,1±3,8 % (p < 0,05). В случае ранней активации (23-25 ч) доля слившихся комплексов, развившихся до стадии бластоцисты, составила 29,4±4,8 %. С увеличением возраста ооцитов до 26-28 ч наблюдалось снижение этого показателя до 14,6±2,2 % (p < 0,05). Таким образом, показано, что эффективность клонирования зависит от интервала между слиянием и активацией, а также возраста MII ооцитов на момент активации слившихся комплексов (оптимальные параметры применительно к описанному нами протоколу — соответственно 2 и 23-25 ч). Также очевидно, что повторное электрослияние энуклеированного ооцита и соматической клетки не оказывает отрицательного воздействия на качество образовавшихся цитогибридов, а следовательно, может быть использовано в рамках процедуры получения клонированных эмбрионов у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, соматическое клонирование, слияние, активация, эмбриональное развитие.
in vitro DEVELOPMENT OF CLONED EMBRYO IN CATTLE IN RELATION WITH FUSION AND ACTIVATION PARAMETERS
G.N. Singina, A.V. Lopukhov, E.N. Shedova
Embryo production through somatic cloning technology has the perspectives for application in reproductive biotechnologies in cattle in order to multiply the most productive and unique genotypes in livestock breeding and create new genotypes using genome editing. Success of somatic cloning depends on the ability of donor somatic cell nucleus (karioplast) to be reprogrammed to totipotent state. Relevant transformations of donor nucleus are mediated by oocyte cytoplasmic factors (cytoplasts) and start from the moment of their association (fusion). Effects of oocyte cytoplasm are direct and depend on many factors. The objective of the present study was to evaluate the cloning efficiency in terms of time of oocyte cytoplasm exposure to donor nucleus before activation, the time of oocyte maturation before their activation in the fused complexes (cytohybrids), and repeated electrofusion of the cytoplast and karyoplast. The effects of these factors on formation of cloned embryos and development to blastocyst stage were studied. Isolated oocyte-cumulus complexes (OCCs) were in vitro matured in TC-199 medium supplemented with 10 % fetal bovine serum, 10 μg/ml of FSH and 10 μg/ml of LH. After 20-24 h of maturation, OCCs were treated with a 0.1 % hyaluronidase, then cumulus cells were mechanically removed and the oocytes with the first polar body were selected. Long-time conserved fetal fibroblasts were in vitro cultured up to monolayer and maintained in contact inhibition during 2 days. Then, cell suspension was prepared for transferring into enucleated oocyte. Somatic cell was transferred to perivitelline space of the oocyte, and two consecutive rectangular 20 μs pulses at constant current with a voltage of 35 V were performed (once or twice if there were no signs of cell-oocyte fusion). The obtained cytohybrids were activated with the ionomycin 1 or 2 hours after fusion (recipient oocytes were matured either 23-25 hours or 26-28 hours). Activated cytohybrides were then cultured up to blastocyst stage. Oocyte cleavage rate were similar in all experimental groups (60.7 to 70.4 %). Blastocyst development rate did not differ between the groups where single or double fusions were performed (29.4±4.4 and 22.8±3.5 %, respectively). Blastocyst rate was 17.4±2.6 % at 1-hour interval between fusion and activation. Two-hour interval increased blastocyst rate to 31.1±3.8 % (p < 0.05). In the case of early activation (23-25 hours of maturation), 29.4±4.8 % of fused complexes developed to the blastocyst stage. With an increase of oocyte maturation time to 26-28 hours, blastocyst rate decreased to 14.6±2.2 % (p < 0.05). Therefore, cloning efficiency depends on the interval between cytohybrid fusion and activation, and the age of MII oocytes at the time of activation of the fused complexes; 2 hours and 23-25 hours, respectively, were the optimal parameters. In addition, the repeated electrofusion of the enucleated oocytes and somatic cells did not affect cytohybrid quality, and, therefore, this procedure can be used for somatic embryo cloning in cattle.
Keywords: cattle, somatic cell nuclear transfer, fusion, activation, embryo development.
ФГБНУ ФНЦ животноводства — |
Поступила в редакцию |
