БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2020.2.364rus

УДК 579.62:[573.6.086.83+577.21]

Исследование выполнено при финансовой поддержке Правительства Пермского края в рамках научного проекта № С-26/792, а также Словенского исследовательского агентства (ARRS), гранты № P1-0198 и № BI-RU/16-18-047.

 

БИОПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ШТАММА Escherichia coli ŽP. Сообщение I. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОЛИЦИНА ПРИ КОНЪЮГАТИВНОЙ
ДОСТАВКЕ colE7 В КЛЕТКИ APEC in vitro И in vivo

М.В. КУЗНЕЦОВА1, И.Л. МАСЛЕННИКОВА1, Ю.С. ГИЗАТУЛЛИНА1,
D. ŽGUR BERTOK2, M. STARČIČ ERJAVEC2

Обеспечение защиты сельскохозяйственных животных от инфекционных болезней — приоритетное направление ветеринарной медицины. Широкое распространение в птицеводческих хозяйствах патогенных и условно-патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам, требует разработки современных способов поддержания здоровья птицы при ее промышленном производстве. В качестве меры по предупреждению и ограничению распространения возбудителей с устойчивостью к противомикробным агентам перспективно использование бактериальных препаратов направленного действия — пробиотиков. В настоящей работе в экспериментальных моделях in vitro и in vivo мы впервые показали антагонистическое действие генно-модифицированного штамма Escherichia coli ŽP против возбудителей эшерихиозов у птиц — АPEC (avian pathogenic Escherichia coli). Установлено, что in vitro конъюгативный перенос гена сolE7 в клетки APEC проходит эффективно в условиях как планктонного роста, так и формирующейся биопленки. In vivo штамм E. coli ŽP способен активно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов и сохраняться там, способствуя нормализации микробиоты животных. Цель исследования — оценка эффективности киллинга клеток APEC при конъюгативном переносе гена колицина E7 и определение конкурентоспособности штамма E. coli ŽP in vitro и invivo. В работе использовали ColE7-опосредованную kill—anti-kill систему на основе пробиотического штамма Nissle 1917, включающую генно-модифицированный штамм E. coli ŽP (киллерный донор), несущий на конъюгативной плазмиде pOX38а ген колицина E7 (сolE7) с ДНКазной активностью, а также ген immE7 в хромосоме, и штамм E. coli N4i без colE7 на плазмиде (контрольный донор). В качестве реципиентов использовали устойчивые к ампициллину штаммы APEC (n = 6), изолированные из внутренних органов инфицированных цыплят-бройлеров. Филогенетическую принадлежность культур определяли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (quadriplex PCR). Конъюгативный перенос осуществляли в среде Луриа-Бертани (LB) в течение 6 и 24 ч в планктонной культуре и в биопленке в полистироловых плоскодонных иммунологических 96-луночных планшетах. Опыты на крысах (линия Wistar) и маньчжурских перепелах (Coturnix coturnix) выполняли в виварии (ГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ). Нами экспериментально подтверждена конкурентоспособность E. coli ŽP при совместном культивировании с клетками APEC штаммов, в том числе продуцентами бактериоцинов, в различных моделях. Доказан конъюгативный перенос гена сolE7 в клетки APEC in vitro в условиях планктонного роста и формирующейся биопленки: в экспериментах с донорным штаммом E. coli N4i частота конъюгации варьировала в пределах 10-6-10-2. Эксперимент in vivo показал, что штамм E. coli ŽP способен эффективно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов, сохраняясь там, как минимум, в течение 1 мес. Введение клеток E. coli ŽP с питьевой водой увеличивало общее содержание комменсальных эшерихий в кишечнике, подавляя развитие патогенных представителей этого вида без заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору. Доказана возможность конъюгативного переноса плазмиды от донора E. coli N4i в условиях кишечного тракта обоих видов животных, который происходил с высокой частотой (в среднем 10-2). В экспериментах in vitro и in vivo с E. coli ŽP трансконъюганты обнаружены не были, то есть клетки реципиентов, получившие ген сolЕ7 посредством конъюгативного переноса, экспрессировали его и были лизированы вследствие ДНКазной активности колицина. В группах, получавших штамм ŽP, также отмечено снижение числа реципиентов АРЕС. Полученные результаты свидетельствуют, что штамм E. coli ŽP способен эффективно заселять кишечник животных и обладает антибактериальной активностью против энтеропатогенов за счет конъюгативного механизма передачи гена колицина. Он эффективно действует на резистентные и толерантные к бактериоцинам клетки, что позволяет предположить возможность создания на его основе высокоэффективного пробиотического препарата нового поколения.

Ключевые слова: колицины, СolE7, конъюгативный перенос, kill—anti-kill система, альтернатива антибиотикам, пробиотики, патогенные Escherichia coli птиц (APEC), подопытные животные.

 

 

А PROBIOTIC BASED ON THE Escherichia coli ŽP STRAIN. I. EFFICIENCY ASSESSMENT OF THE CONJUGATIVE TRANSFER OF THE COLICIN E7 ACTIVITY GENE INTO AVIAN PATHOGENIC E. coli STRAINS in vitro AND in vivo

M.V. Kuznetsova1, I.L. Maslennikova1, J.S. Gizatullina1, D. Žgur Bertok2, M. Starčič Erjavec2

The protection of farm animals against infectious diseases is a priority in veterinary medicine. The wide spread of pathogenic and opportunistic bacteria resistant to antibiotics on poultry farms requires the development of modern methods to maintain the health of birds in industrial production. A promising direction to improve measures to prevent and limit the spread of pathogens resistant to antimicrobial agents is the use of targeted bacterial drugs — probiotics. Veterinary probiotics based on genetically modified microorganisms can be used for the treatment and prophylaxis of infectious diseases in farm animals. We demonstrated the antagonistic effect of the genetically modified Escherichia coli ŽP strain against agents of avian colibacillosis, the avian pathogenic Escherichia coli (APEC) in both in vitro and in vivo models. The colE7 gene (colicin E7 synthesis gene) carried on a conjugative plasmid was efficiently transferred by conjugation in conditions of planktonic and biofilm growth in vitro. The E. coli ŽP strain was shown to actively colonize the intestine of rats and quails and to contribute to beneficial effects of the microbiota. Our aim was to evaluate the competitive ability of the E. coli ŽP strain as well as the efficiency of killing APEC based on the conjugative transfer of the colE7 gene, encoding a DNasae, in vitro and in vivo. We used the ColE7-mediated kill—anti-kill system based on the Nissle 1917 probiotic strain, the genetically modified E. coli ŽP strain (killer donor) carrying the colE7 gene on the conjugative plasmid pOX38a, as well as the immE7 gene (colicin E7 immunity gene) on the chromosome. As control, the E. coli N4i strain without colE7 gene on the conjugative plasmid pOX38 (control donor) was used. Six APEC strains with resistance to ampicillin isolated from organs of broilers with colibacillosis were used as recipients in performed conjugation assays. The phylogenetic group of used APEC strains was detected with quadruplex PCR. The conjugation transfer was conducted in Luria-Bertani (LB) medium in immunological polystyrene 96-walls flat bottom plates in plankton and in biofilm culture. The experiments with rats (Wistar line) and Manchurian quail (Coturnix coturnix) were conducted in the vivarium of the Wagner Perm State Medical University. The competitive ability of E. coli ŽP strain was confirmed in co-cultivation assays with APEC strains, including bacteriocin producers, in various models. Conjugative colE7 gene transfer to APEC was detected in vitro in plankton and in biofilm: in experiments with the control donor strain E. coli N4i the conjugation frequency varied from 10 -6 to10-2. In vivo, it was shown that E. coli ŽP strain was able to effectively colonize the rat (line Wistar) and Manchurian quail (Coturnix coturnix) intestine and persist there at least for a month. Introduced E. coli ŽP cells increased the total amount of commensal Escherichia in the intestine of the animals and reduced the growth of the pathogenic microbes without affecting the lactic acid bacteria. The transfer ability of the conjugative plasmid pOX38 in the intestinal tract of both animal species was demonstrated. The conjugation in the intestinal tract occurred with a high frequency, on average 10-2. No transconjugants were detected in both in vitro and in vivo experiments with the E. coli ŽP strain harboring the conjugative plasmid pOX38a; the recipient cells that received the colE7 gene via the conjugative transfer expressed it and were lysed due to the colicin DNase activity. This was reflected in the number of APEC recipient cells, it was namely reduced in the assays with the ŽP strain. The results obtained indicated that the E. coli ŽP strain was able to colonize the intestine of animals and had antibacterial activity against enteropathogens due to the conjugative mechanism of colicin gene transfer. As the ŽP strain was also effective on APEC cells that were resistant and tolerant to bacteriocins, it has the potential to become the basis for a highly effective new generation of probiotics.

Keywords: colicins, СolE7, conjugative transfer, kill—anti-kill system, antibiotic alternative, probiotics, avian pathogenic Escherichia coli (APEC), animal models.

 

1Институт экологии и генетики микроорганизмов
УрО РАН — филиал Пермского федерального
исследовательского центра УрО РАН,
614000 Россия, г. Пермь, ул. Голева, 13,
e-mail: info@iegm.ru, mar@iegm.ru ✉, i.maslennikova1974@gmail.com, gizatullina.julia@yandex.ru;
2Department of Biology, Biotechnical Faculty,
University of Ljubljana,
Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, Slovenia, e-mail: biologija@bf.uni-lj.si, darja.zgur@bf.uni-lj.si,
marjanca.starcic.erjavec@bf.uni-lj.si

Поступила в редакцию
12 января 2020 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML